肝纤维化动物模型的研究进展

冯天航，姚豫桐，黄孝伦△

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆胰脾外科细胞移植中心，四川 成都 610072)

△通讯作者

肝纤维化动物模型的研究进展

冯天航1，姚豫桐2，黄孝伦2△

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆胰脾外科细胞移植中心，四川 成都 610072)

肝纤维化是各种因素引起慢性肝脏损伤的一种“损伤修复”慢性进展性病理过程，是向肝硬化发展的过渡环节也是欲阻断纤维化继续发展的关键环节。本文根据肝纤维化动物模型制备的机制、途径、效果以及优缺点的等方面进行综述，为不同研究方向选择肝纤维化动物模型提供参考。

肝纤维化；动物模型；化学性肝纤维化法；酒精性肝纤维化法；免疫性肝纤维化法；胆管阻塞性肝纤维化法；复合因素性肝纤维化法

当药物、免疫、基因等多种因素引起肝脏组织受损后，肝组织内细胞外基质(ECM)合成降解动态平稳失调引起肝细胞变性、坏死、增生，肝纤维结缔组织增生、沉积，导致肝脏结构和功能发生异常改变，称为肝纤维化。此病理过程具有全身性、序贯性的特点[1]。目前临床普遍认为肝纤维化是慢性肝脏疾病发展为肝硬化、恶变为肝癌的必经过程，并且是肝病治疗的关键环节[2]。因此肝病权威专家Hans Popper教授曾提出“谁能阻止或延缓肝纤维化的发生，谁就将治愈大多数慢性肝病”这一说法[3，4]。为了深入探讨肝纤维化的发病机制及其病理生理过程，寻找治疗有效药物和方法，国内外学者们建立了一系列比较成熟、稳定且重复性和成功率可靠的肝纤维化动物模型制备方法。目前应用比较广泛的肝纤维化动物模型有化学性肝纤维化模型、酒精性肝纤维化模型、免疫性肝纤维化模型、胆管阻塞性肝纤维化模型和复合因素性肝纤维化模型等。本文就不同类型的肝纤维化动物模型，对其制备的机制、途径、效果以及优缺点等方面综述如下。

1 化学药物诱导肝纤维化动物模型

目前以化学药物诱导的动物肝纤维化模型的常用药物有：四氯化碳(CCl4)、 二甲基亚硝胺(DNM)、 D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)和硫代乙酰胺(TAA)等。

1.1CCl4法CCl4法是目前应用最广泛的肝纤维化造模方法。CCl4致肝硬化的主要机制为：肝细胞吸收CCl4后产生CCL3自由基导致肝细胞膜物质脂质过氧化，破坏肝细胞功能，肝脏内脂蛋白合成过程受影响，狄氏间隙内贮脂细胞活化引起肝内脂肪聚集使线粒体受损，脂肪代谢障碍，同时肝细胞释放出IV型胶原酶降解IV型胶原，加重肝细胞脂肪变性。经试验观察，长期给予CCL4持续刺激成纤维细胞大量表达I型胶原基因，从而使I型胶原合成增多，取代IV型胶原促使肝脏纤维化。整个过程中的免疫/炎症反应和肝细胞变性、坏死常于纤维化前发生[5]。

CCL4法造模途径有：腹腔注射法、皮下注射法和灌胃法等，并且辅以低蛋白、高脂肪食物及乙醇饮料共同作为饮食控制条件，可增加各种动物对CCL4的敏感性，缩短建模周期[6]。由于给药途径、剂量及时间不同，模型建成的周期为6～18周。丁可应用400 ml/L CCL4溶液以1 ml/kg每周两次注射食蟹猴，于16周成功建立肝纤维化模型，成功率约75%[7]。另有实验研究予大鼠以CCL4皮下注射，配合高脂低蛋白饮食6周建立肝纤维化模型[8]。

CCL4法诱导的动物肝纤维化模型与人类肝纤维化相似度高，病理生理和形态学上表现一致，均有肝细胞坏死后再生。具有造模相对容易、廉价及周期短的特点。但是此方法动物死亡率高、个体差异大，并且模型在停药后有逆转倾向。

1.2DNM法DMN是一种具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的药物。其造成肝硬化的机制主要是通过进入体内后生成乙醛通过肝微粒体代谢引起肝细胞损害，同时，由于活性代谢产物促进甲基化反应，使核酸、蛋白质等重要物质发生性变，引起肝细胞变性坏死并且细胞外基质进行性增加，从而形成肝纤维化[9]。

DMN法给药途径以腹腔注射为主[10]。成模时间根据给药剂量、给药浓度的不同，一般造模周期为4～6周。DMN法相比于CCl4法诱导模型造模时间更短、死亡率更低、模型更稳定。其最主要特点是可造成门脉高压，病理生理、形态学上与人类早期肝硬化改变相似，有助于研究门脉高压和肝硬化的发生机制和治疗手段。但此方法缺陷在于大剂量DMN易引起肝细胞坏死性出血，控制肝脏纤维化程度的难度增加，而且DMN是致癌物质、常温易挥发，且动物排泄物中含有毒物，污染环境，对实验者和实验室条件要求较高。

1.3D-GalN法D-GALN属于间接肝毒剂，其进入体内后与肝细胞内尿苷二磷酸(UDP)结合形成复合物，消耗核苷三磷酸(NTP)，使肝细胞中的核苷酸(RNA)与蛋白质合成受阻，同时能产生自由基及脂质过氧化物，破坏细胞膜的结构和功能，诱导肝细胞坏死，从而启动细胞的“创伤修复”形成肝纤维化[11]。

D-GalN法经皮下、腹腔和静脉注射给药均可。一次性腹腔给药后24～48小时即可以形成急性肝损伤模型[12]。D-GalN法形成的肝纤维化与人类急性病毒性肝炎的肝脏病变相似度高，其病理学特点是似小结节性，可见再生肝细胞团，外包裹多层网状纤维，结缔组织和胶原及弹性纤维形成，另外其生化、组织学特征接近于人，重复性好，对观察、预防肝纤维化、急性肝衰竭的发生发展具有较高研究价值。虽然D-GalN仅损害肝脏，不对其他器官造成影响，但因药物价格高昂，未能在实验中普及。

1.4TAA法TAA具有致癌性，其进入体内后在细胞色素P450介导下发生氧化应激，产生自由基和活性化合物等物质，随后参与肝内物质结合，延长肝细胞有丝分裂过程，妨碍RNA从胞核转移到胞质，影响依赖酶代谢过程，从而导致肝细胞坏死、再生结节形成、毛细胆管增生，形成纤维隔及门静脉高压，进而导致肝硬化[13]。

大鼠皮下注射TAA 6～8周后可见肝脏内形成明显的假小叶[14]。TAA法在血流动力学、形态学及生化代谢改变均与人肝纤维化相似度高，且与病毒性肝炎引起的肝硬化相似。此法相对于CCL4法和DMN法，成模时间更短，死亡率更低并且稳定性更优，操作简单易控，重复性强，但与DMN法有相同的弊端——其具有致癌性、易挥发性、毒性大、体内代谢时间长和易污染环境的特点。

目前除了上述常用化学方法制备的肝纤维化模型，还有实验者使用异烟肼和利福平联用制备肝纤维化动物模型取得了较好的实验结果。[15]另外有文献报道利用甲氨蝶呤腹腔注射法成功复制出肝纤维化动物模型[16]。

2 酒精性肝纤维化动物模型

乙醇会引起肝脏的三种损伤变化：脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。但是目前酒精对肝损伤的机制尚未完全明确，普遍认为其发生机制是多方面因素共同作用的结果——氧化应激、免疫/炎症反应、线粒体与内质网受损等[17]。首先，乙醇在肝脏经过氧化代谢，通过乙醇脱氢酶(ADH)和微粒体乙醇氧化酶系统(MEOS)进行，最终产生乙醛。乙醛通过影响三羧酸循环，导致脂肪代谢异常，造成脂肪堆积、坏死，同时激活“创伤修复”过程，刺激贮脂细胞转变为成纤维细胞，并合成分泌大量胶原沉积，引起肝纤维化。其次，因乙醇易造成营养不良，是导致肝细胞的坏死因素之一，进一步加重了肝纤维化。

6月上旬柑橘产量与日照时数呈显著负相关。光照是柑橘生长发育最根本的条件，在适宜范围内，随光照时数、强度的增加，光能利用率高，柑橘生长健壮、枝叶充实，花芽分化良好，产量高、品质佳。当阳光过强，不利于柑橘生长，会引起日灼［12］。6月柑橘处于第二次生理落果和幼果膨大期，阳光直射果实、枝干和树叶，使其表面温度达到45℃以上并持续较长时间，即可引起灼伤，影响产量和品质［7］。

乙醇法的给药途径主要靠灌胃或稀释后加入饮用水中，相比之下后者安全性更高，避免了灌胃操作中误插气管的可能，因方法与剂量选择上的不同，成模需要10～16周[18]。其模型病理特点与人的酒精性肝病相似，肝细胞脂肪变性、坏死严重以及炎细胞的浸润，可见明显的桥接坏死改变。因此法与人类酒精性肝病相似，可以很好地用于人类酒精性肝纤维化的研究。此法死亡率低且成本也较为低廉，并且灌胃法可确保每只大鼠的酒精摄入量符合实验要求，造模稳定性高。但是其容易出现厌食、消瘦等全身不良反应，相比前述方法需要更长的周期才能成功建立模型。

3 免疫性肝纤维化法动物模型

免疫性肝纤维化法造模也是实验室较为常用的造模方法，目前建立免疫性肝纤维化模型比较成熟的方法有：异种血液制品法、刀豆素蛋白A法及血吸虫感染法等。

3.1异种血液制品法异种血液制品法总共分为两大类，一类是异种血清，另一类是异种血清白蛋白，二者在作用机制上相似，均是以猪血清、牛血清、人血白蛋白等作为抗原[19]，注射到动物体内，刺激动物体内产生抗体，激活抗原抗体反应，最终发生免疫复合物沉积，该反应属于Ⅲ型变态反应。复合物主要沉积在门脉汇管区，引起周围血管局部炎症，激活静止的贮脂细胞转化为成纤维细胞，其反应过程类似于CCL4法——细胞外基质均是以降解IV型胶原、分泌I 型胶原蛋白为主要作用，最终形成纤维化。

异种血液制品注射法经静脉注射或腹腔注射给药均可，但由于反复静脉注射易造成动物的静脉炎，因此常以后者为主。无论选择血清制品或白蛋白制品建立模型的周期均为8周左右[20]。该模型在病理生理上更符合人类慢性肝纤维化形成的过程，血清及肝组织局部TGF-β1含量较少，窦状隙毛细血管化较明显[21，22]。该模型适合于研究由慢性肝炎或免疫性肝病引起的肝纤维化方面的问题。该类模型个体差异较大、建立模型周期长、由于过敏反应死亡率也较高，但该模型复制性好、稳定性强，故在实验室可有选择性的使用。

3.2刀豆素蛋白A法(ConcanavalinA，ConA) ConA诱导的肝纤维动物模型主要作用机制为：ConA是T细胞的有丝分裂原，T细胞可以被ConA激活而分泌多种细胞因子，引起肝组织的特异性损伤，继而发生炎症反应，表现为肝细胞周围产生以CD4+T细胞为主的大量淋巴细胞浸润[23]。免疫介导的炎症反应加重了肝脏的损伤促使了肝纤维化的形成。Con A法的常用给药途径是静脉注射，建立模型的周期为8周左右[24]。该模型在发病机制上的特点与异种血清制品法接近，病理过程中肝细胞受损不严重，炎症反应引起胶原沉积为其主要表现，在病理形态学上可见肝小叶结构改变，同时可见点状坏死、片状坏死，周围炎性细胞浸润，适合予以研究肝纤维化免疫疾病、吞噬细胞、Ito细胞及自身免疫性肝病等方面问题[25]。该法操作简便、成功率高、稳定性好不易逆转。

3.3血吸虫感染法血吸虫感染法是由血吸虫虫卵诱导肝纤维化形成，虫卵进入体内后依次阻塞肝内门静脉、门静脉周围侧枝循环；同时虫卵形成的肉芽肿分泌细胞刺激因子，刺激成纤维细胞增殖，导致胶原成积引起肝纤维化[26]。血吸虫感染法是通过表皮感染血吸虫尾蚴，进而发生上述过程。模型建立周期尚需13周左右。鉴于模型形成的特殊性，该方法仅对我国血吸虫疫区人肝纤维化的发生有重要的研究和防治指导意义，但该模型不仅存在自身的局限性，还可能对实验人员发生感染、产生实验环境污染等问题，因此应用较为受限。

4 胆管阻塞性肝纤维化法(BCM)动物模型

BCM模型经人为造成肝外胆管阻塞，进而形成肝纤维化。主要有单纯结扎肝外胆管法、胆管结扎后切断法和逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸盐法三种方式[27～29]，引起梗阻以上部位的胆管阻塞，以致胆汁淤积、胆道压力升高、肝细胞外环境改变，引起肝细胞缺血、变性和坏死，纤维组织增生，继而演变成肝纤维化。

BCM法建立形成的肝纤维化模型接近于临床上的胆汁淤积性肝纤维化，此模型的建立周期为5天[30]，其优点为接近临床淤积性肝纤维化表现、建立模型周期短、稳定性高、无毒和不易自发逆转，但缺点也较明显：模型死亡率高，手术复杂并且模型长期存活率较低。综上，该模型更适于研究门脉高压性肝纤维化和胆汁淤积性肝纤维化等急性反应方面的相关问题。

5 复合因素性肝纤维化动物模型

上述方法都是单因素形成模型，有不同的形成机制，制作的难易程度也不同，适用于不同的研究类型，所以研究者们可根据自己的模型需要，组合各种因素，以更安全的流程、更短的模型建立周期、更精准的获得理想动物模型。这种结合多种因素方法对动物进行肝纤维化模型建立的方法称之为复合因素方法。悉尼大学临床医学院Le Couteur教授先用苯巴比妥诱导肝酶作用于肝脏，于2周后加用CCl4注射建立肝纤维化模型，并发表在药理学及实验治疗学杂志[31]。在著名杂志临床研究学杂志中，Tsukamoto应用了乙醇法的基础上配合含铁剂的饮食[32]。

综上所述，中国病毒性肝炎感染者数量仍十分庞大，根据传染病报告系统数据，仅2016年11月1日0时至11月30日24时病毒性肝炎感染者发病数约12万人，其中乙型病毒性肝炎者占9万人[33，34]。酒精肝、脂肪肝等发病率随着中国人生活质量提高、肥胖人群的增加而猛增，有超过病毒性肝炎发病率的趋势，都有可能发展为肝硬化甚至肝癌。因此对肝纤维化的研究迫在眉睫，而前提是需要建立理想的肝纤维化动物模型，这不仅要追求模型的产生与人类肝纤维化的发生在机制、病理学、血流动力学和生化等多个方面的相似，还需要该模型成功率高、稳定性强、周期短、安全性强以及操作简便、经济等优势。目前尚无符合以上所有理想要求的肝纤维化模型制作技术，仅能根据各个模型的建立方法不一、发生机制不同、特点各异，结合实验的研究目的选择不同的模型建立方法，以尽量满足实验需求。转化医学的出现和推动，给研究者们指出了一个全新的方向——使用高脂饲料联合乙醇及CCL4复合方法建立更接近人类临床的肝纤维化模型以及建立由病毒引起的灵长类肝纤维化模型以研究人类肝纤维化的形成，为进一步研究肝纤维化的有效干预措施提供支持。

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Progress on animal model of hepatic fibrosis

FENG Tian-hang1，YAO Yu-tong2，HUANG Xiao-lun2

R575

B

1672-6170(2017)05-0256-04

2017-02-20；

2017-05-24)