园艺植物小孢子培养技术研究进展

石江鹏，张春芬，李芙蓉，肖蓉，邓舒，侯丽媛，曹秋芬

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

园艺植物小孢子培养技术研究进展

石江鹏1，张春芬2，李芙蓉1，肖蓉2，邓舒2，侯丽媛3，曹秋芬3

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

游离小孢子培养已经成为园艺植物现代育种的一项重要内容。综述了园艺植物小孢子培养的研究进展，详细讨论了小孢子胚胎发生的影响因素，包括材料的基因型、小孢子发育时期、供体植株生理状况、预处理、活性炭、激素，以及胚状体分化成苗的影响因素，并提出了相关的问题与展望，以期为园艺植物的培养提供借鉴。

园艺植物；游离小孢子；胚状体；植株再生

园艺植物是指提供人类食用或观赏的植物，包括果树、蔬菜、花卉、茶树、芳香植物、药用植物和食用菌等，具有较高的经济价值[1]。园艺植物产品已成为现代生活中不可缺少的部分，市场需求在逐年增加。采用传统的方法培育生产园艺植物，由于育种周期长、选择范围有限、经济性状劣变等，已经不能满足日益增长变化的市场需求[2]。单倍体育种是现代育种的一项重要内容，即利用组织培养技术诱导产生单倍体植株，再经过染色体自然或人工加倍（如用秋水仙素处理）得到纯合的双单倍体（DH）。这种技术可以缩短育种周期、加快育种进程，提高诱变育种效率，以及加快种质资源创新。

单倍体材料可以通过自然发生和人工诱导获得，但是一般情况下自然发生概率很小，不能满足育种工作的需要，游离小孢子培养技术是人工诱导获得单倍体植物的主要途径。在蔬菜方面，1982年LICHTER[3]利用小孢子培养技术对甘蓝型油菜进行培养，成功获得了小孢子胚状体及其再生植株。自此以后，游离小孢子培养技术进入了快速发展阶段。1989年，SATO等[4]首次报道成功诱导出大白菜游离小孢子胚和再生植株。在果树方面，苹果花药培养开始于20世纪70年代末，以德国、日本和中国研究较多。1981年，费开韦等[5]获得元帅花药培养的单倍体植株；吴绛云[6]经愈伤途径获得黄太平花药培养植株。张春芬等[7]获得丹霞、富士、嘎拉、红星、千秋、祝光等品种的再生植株60株，其中，41株系进行了倍性分析，红星和千秋的植株经SSR检测均由花粉发育而来。JORDAN[8]在西洋梨花药培养上获得小原胚；薛光荣等[9]在锦丰梨的花药培养上诱导出胚状体，但诱导率不稳定。在农作物方面，中国科学院遗传研究所[10]首次利用花药离体培养方法获得玉米纯系。杭玲等[11]选育出玉米花培杂交种桂三1号，是国内外用花培方法育成的第1个玉米杂交种；同年我国首次育成粳稻品种单丰1号[12]。目前，在蔬菜、作物、果树上有关小孢子培养技术的报道较多，而在花卉、药用植物方面的报道相对较少。

笔者综述了近年来小孢子培养技术在育种上的应用，着重阐述了小孢子胚胎发生的影响因素，以及胚状体分化成苗的影响因素，并提出了相关的问题与展望，以期为园艺植物的培养提供借鉴。

1 小孢子培养技术在育种中的应用

游离小孢子培养技术是现代新兴细胞工程技术。与传统杂交育种法相比，小孢子培养技术不需要通过长期、繁杂的杂交、回交、自交，就能够快速得到大量完全纯合的个体，便于遗传分析，而且目标性状稳定，提高了选择效率[13]。小孢子培养所获得的双单倍体（DH）纯合群体可直接用于园艺植物育种，由于配子体基因型丰富，花粉来源的株系在株高、抗性、育性等方面表现多样化，构成了形态各样的花培株系[14]。DH系能从亲本获得随机排列的配子，因此，受隐性基因控制的优良性状在DH群体中出现较高的频率。

利用小孢子培养突变方法获得纯合基因型材料用于育种是作物改良的较理想途径，具有速度快、低或无污染特点。小孢子具有单倍性、单细胞性，因而易于进行物理或化学诱变。诱变后经过一定的处理使得染色体加倍，突变性状可以直接在当代植株性状上表现出来，利于提高突变体筛选率[15]。在芸薹属植物中，小孢子刚分离后的单核期是应用突变剂的最佳时期，这个时候产生的突变体易于选择和识别分析[16]。

小孢子是转基因技术的理想材料，从一个小孢子到一个幼龄的单倍体植株都可以作为外源基因转化和转导的受体。与常用的转基因受体相比，小孢子具有极强的再生能力，能有效获得转基因植株[17]。并且单倍体培养体系可以保证转化后的双单倍体系的2条染色体均含有目的基因，能最大限度地减少植株出现嵌合现象，降低后代分离[18]。目前，应用于小孢子培养中的转基因技术主要有农杆菌介导法、显微注射法、粒子轰击法等。

2 园艺植物胚胎发生的影响因素

在小孢子培养再生体系建立过程中，胚状体诱导成功与否是关键性的一步。近年来，国内外关于小孢子培养技术不断发展，对小孢子胚胎诱导因子的研究不断深入，使园艺植物小孢子胚胎诱导率有了明显的提高。

2.1 供体植株

2.1.1 基因型基因型对小孢子的产胚率有很大影响，小孢子胚状体发生能力随试验材料基因型不同而有差异。王利英等[19]在茄子小孢子培养的研究中发现，4℃低温预处理天数并不影响愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率只与基因型有关。曹秋芬等[20]对苹果9个品种进行了胚状体诱导，有8个品种获得了胚状体，且各品种间诱导率差异显著，其中，祝光苹果的花药胚状体诱导率最高，可达24.7%，而富士苹果仅有0.1%。方淑桂等[21]对花椰菜80个品种进行胚状体诱导，发现有20个供试品种获得了胚状体，且胚胎发生率存在显著差异，最高基因型产胚率是最低基因型产胚率的182.5倍。方辉等[22]对15份不同基因型的青梗菜进行了研究，结果表明，只有10个供试品种获得胚状体，其中，GP-2，GP-4，GP-15出胚率相对较高，分别达1.04，0.87，0.89胚/蕾，其余7个品种的出胚率较低，在0.5胚/蕾左右。吴艺飞等[23]在试验中发现，将出胚率低的品种与出胚率高的品种杂交后，F1出胚率会大大提高，这说明影响出胚的基因是由多对基因控制的，且这种基因是可遗传的。能否通过优化培养条件来克服基因型对小孢子培养的限制，还需进一步的试验验证。

2.1.2 小孢子发育时期小孢子发育时期会影响胚状体的诱导率，多数研究表明，处于单核靠边期至双核早期的小孢子细胞更有利于胚状体的诱导。张德双等[24]对绿花菜进行花药培养比较发现，双核期影响较大。果树中的杏树花药培养以小孢子发育到四分体或单核期为宜[25]。甜橙和荔枝在单核期培养效果最佳[26-27]。ZHANG等[28]对苹果花药培养中花粉发育时期对苹果胚状体诱导率的影响进行了详细的研究，结果表明，低温处理后单核靠边期至双核早期的小孢子最为适宜。

在小孢子培养中，花蕾的外部形态特征（如花蕾长度，花药颜色、大小，花瓣长/花药长等）与小孢子发育时期相关，因此，可作为小孢子发育时期的指标[29]。吴艺飞等[23]研究表明，同一红菜薹品种小孢子发育不同时期和不同品种处于同一小孢子发育时期的花蕾纵径、横径、花萼长度、花瓣长度以及瓣萼比存在显著差异。在羽衣甘蓝游离小孢子培养中，适宜于培养的花蕾形态指标为：花瓣长/花药长的值为（0.85～1.10）∶1，蕾长3.5～4.5 mm[25]。

2.1.3 供体植株生理状况研究表明，供体植株的生长条件对小孢子发育同步化程度和胚状体诱导产生重要影响，不同的生长条件下，供体植株小孢子发育同步化程度和胚状体诱导存在显著差异[30]。在玉米小孢子培养研究中，生长期间的最低温度影响小孢子的胚状体诱导[31]。在油菜的研究中发现，甘蓝型油菜小孢子在单株开1朵花后的14 d时间培养效果最好，白菜型油菜在培养前将花蕾置于4℃胚胎诱导率高，大田气候条件下小孢子培养最佳取样时间为上午7：00，此时湿度大，温度低，小孢子发育同步化程度高[32]。在小麦小孢子培养研究中，病虫害情况是影响小孢子培养的重要因素，健壮无病虫害供体植株的小孢子活力强、污染率低，是小麦小孢子培养的最佳材料选择[33]。

2.2 小孢子培养条件及培养基成分

2.2.1 预处理预处理在小孢子发育中应用较广泛，包括热激预处理、低温预处理及秋水仙素预处理等。预处理能够改变小孢子的发育途径。

热激预处理能够使小孢子的发育途径由配子体转向孢子体，从而增加小孢子培养中的产胚率。高温热激预处理的温度、时间因供体植株的差异而不同。在甘蓝研究中发现，不同温度小孢子发育的途径不同，小孢子在32.5℃条件下培养趋向于孢子体发育，而在17.5℃条件下培养趋向于配子体发育[34]。

低温预处理方法在游离小孢子培养中被普遍采用，在甘蓝型油菜、青花菜的应用中较多。曾爱松等[35]对甘蓝游离小孢子培养初期进行4℃预培养，胚胎发生的诱导作用不大。孙继峰[36]在青花菜研究中发现，高温比低温对小孢子胚胎发生的诱导效率要高，而组合处理的诱导率比单独的诱导效率高很多。张春芬等[37]在苹果花药培养研究中发现，低温预处理能够提高苹果花药培养形成胚状体的能力，特别是低温预处理25 d后，花粉有较高的胚状体形成能力。

2.2.2 活性炭不少试验研究表明，小孢子培养过程中，没有胚胎发生能力的小孢子能释放出一些有毒物质，会降低胚状体发生频率，改变胚的形态。在培养基中加入适量的活性炭后，可加快离体培养进程，提高小孢子产胚率，对小孢子培养有十分重要的作用[38]。

活性炭并非对所有培养材料的小孢子培养都能起作用。田保明等[39]对油菜TR9和TR4这2种材料进行研究，结果表明，添加活性炭0.5 mg/L分别是未添加的对照小孢子胚产量的1.82倍、1.21倍。而刘雪平等[40]研究表明，浓度为0.05%的活性炭对甘蓝型油菜小孢子再生胚促进作用不明显。研究发现，活性炭处理获得的胚状体在萌发、成苗等方面都差于未经活性炭处理的小孢子胚，原因可能是活性炭不仅吸收游离小孢子培养中的有害物质，还吸收一些生长调节剂、铁盐、维生素等与胚发生密切相关的物质[38]。因此，对于不同试验材料的活性炭最适浓度还需进一步探究，否则会起负作用。

2.2.3 激素在游离小孢子诱导培养中，添加不同的植物生长调节剂对园艺植物胚状体诱导的影响存在差异。近年来，国内外学者对6-BA和NAA对小孢子胚胎发生的影响研究较多。在小白菜游离小孢子的研究中，李岩等[41]研究表明，在培养基中添加少量6-BA和NAA激素与不加生长调节剂的对照相比，其产胚率明显提高；徐艳辉等[42]研究发现，添加6-BA可以提高大白菜胚状体的诱导率，但是它对难出胚状体的品种仍没有效果，而高浓度的6-BA会对易出胚状体的品种起抑制作用；付文婷等[43]研究表明，有些易出胚状体的大白菜不加任何激素也能出胚，添加激素反而出胚少或不出，而且添加激素会产生畸形胚。可见，有关外源激素对植物游离小孢子培养作用的研究还未达成一致的结论，关于难出胚材料的激素配比、激素选择还需进一步研究。ZHANG等[44]研究表明，在苹果花药培养过程中培养基激素的浓度影响胚胎形成率。

3 园艺植物小孢子胚分化成苗的影响因素

在游离小孢子培养中，小孢子胚分化成植株是重要的环节之一。研究发现，影响胚发育成植株的外部因素有植株再生所需的培养基组成、温度、光照条件、通气状况等，内部因素有胚状体的生理状况、胚龄的长短等。

胚状体的形态特征影响胚状体发育成植株，健康的子叶型胚转到成苗培养基上后成苗能力最强，鱼雷型胚状体的再生能力很差，球型胚几乎不能发育成正常的植株。胚龄的长短对胚状体成苗影响很大，胚龄过长和过短均不利于成苗。胚龄过短，胚状体容易出现玻璃化或黄化，生长不良而死；胚龄过长，胚状体分化能力减弱，易褐化导致成苗率下降[23]。

低温处理对胚状体的成苗率也有一定的影响。HANG等[45]研究表明，低温处理甘蓝型油菜能迅速直接成苗；在对油菜小孢子胚状体出苗率影响的研究中发现，把胚状体转移到固体培养基上先低温（2℃）培养，然后常温培养，可提高直接成苗率[46]；余凤群等[47]将甘蓝型油菜小孢子胚状体转至固体培养基后，置于10℃低温诱导10 d，直接成苗率达到51.2%，明显优于未经过低温处理的对照。

培养基成分是小孢子胚芽分化的重要影响因素。刘凡等[48]研究发现，胚状体在NLN13液体培养基中培养20～25d后，转接到固体分化培养基中成苗效果最好。付文婷等[43]研究表明，在B5培养基上对大白菜的小孢子胚进行培养，植物生长调节剂配比对丛生芽的产生有重要影响，各处理丛生芽诱导率有很大差异。张亚丽等[2]在不含任何激素的B5培养基上，白菜胚状体均发生愈伤化，最终褐化死亡。

4 展望

随着单倍体育种体系的不断发展，游离小孢子培养体系进一步得到完善。小孢子培养技术作为一种高效、安全、快速的育种手段受到了越来越多国内外学者的重视。园艺植物和人类密切接触，栽培量逐年上升，已成为提高生活质量的重要指标之一。通过分析小孢子培养技术研究进展，小孢子胚胎发生、胚状体分化成苗的影响因素，发现有几个方向的研究还存在不足，今后的研究应集中在以下几个方面进行。

（1）有关小孢子培养技术的报道较少，且这些研究所用的材料多为作物和蔬菜，而有关果树和花卉的游离小孢子培养的报道更少。在前人已有的研究基础上，需要进一步完善花卉、果树游离小孢子培养体系。

（2）根据国内外学者的研究结果，影响小孢子胚胎发生的因素主要有基因型、小孢子发育所处的时期、小孢子的生理状况、培养基和培养条件等，制约胚分化成植株的因素主要有培养基组成、温度、通气状况、生理状况等。如何打破小孢子胚胎发生以及胚分化成苗的制约因素，还需研究人员继续探索。

（3）探明小孢子胚胎发生过程中的遗传表现以及染色体加倍的时间、原因等，对小孢子培养进行进一步的遗传改良，提高育种的选择效率，加速育种进程，为园艺植物小孢子培养技术的应用提供更为广阔的前景。

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Research Advances on Microspore Culture Technology of Horticultural Plants

SHI Jiangpeng1，ZHANGChunfen2，LI Furong1，XIAORong2，DENGShu2，HOULiyuan3，CAOQiufen3
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Microspore culture became an important content of modern breeding of horticultural plants.This paper reviewed the research progress in microspore culture of horticultural plants,factors affecting microspore embryogenesis were discussed in detail, including genotype,microspore development,donor plant physiological status,pretreatment,activated carbon,hormone,and factors affecting the differentiation ofembryoid bodies into seedlings.And the paper put forward the problems and prospects to provide reference for the cultivation ofhorticultural plants.

horticultural plants;isolated microspore;embryoid;plant regeneration

S601

A

1002-2481（2017）04-0669-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.43

2016-12-27

国家自然科学基金项目（31372033）；山西省国际合作项目（2014081040）；山西省农业科学院博士基金研究项目（YBSJJ1515）

石江鹏（1992-），女，山西忻州人，在读硕士，研究方向：种质资源创新与利用。曹秋芬为通信作者。