偃麦草属分子标记开发研究进展

朱艳，畅志坚，张晓军，李欣，詹海仙，郭慧娟，乔麟轶

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原030031）

偃麦草属分子标记开发研究进展

朱艳1，畅志坚2，张晓军2，李欣2，詹海仙2，郭慧娟2，乔麟轶2

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原030031）

偃麦草具有小麦育种中需要的优质、抗病、耐盐碱等诸多优良性状，为充分发掘偃麦草在提高小麦品质和抗性方面的应用潜力，列举了3种偃麦草特异分子标记开发情况，阐述了其在小麦育种中的应用现状，分析了开发偃麦草分子标记技术存在的问题，以期促进偃麦草分子标记更好地应用于小麦遗传育种。

偃麦草；育种应用；标记开发

偃麦草属（Thinopyrum）植物是禾本科小麦族（Triticeae）多年生草本植物，世界范围内约有50种偃麦草属植物，我国现有长穗偃麦草（Th.elongatatum）、中间偃麦草（Th.intermedia）、茸毛偃麦草（Th. trichophora）、硬叶偃麦草（Th.smithii）等[1]。偃麦草属植物因具有抗寒、抗旱、耐盐碱、品质优良等性状而多被用来作饲草，也是防风固沙、水土保持的理想植物[2-3]。该属植物是小麦的三级基因库，具有小麦缺乏的优良基因及性状，同时它与小麦的染色体组相近，且易于小麦杂交，因而，被广泛应用于小麦抗病育种[4]。偃麦草中的E基因组是小麦族中很重要的一个基本基因组，该基因组包含Ee和Eb2个亚基因组。依据系统分类学研究，推断Ee和Eb基因组的真正供体分别是Th.elongatum（2n＝2X＝14，EeEe）[5]和Th.bessarabicum（2n＝2X＝14，EbEb）[6]。目前应用最多的是长穗偃麦草、百萨偃麦草、中间偃麦草，在小麦的抗病和品质改良上充分体现了其价值。

分子生物学技术的飞速发展使得在分子水平上检测外源遗传物质成为可能。其中，分子标记技术被广泛用于小麦异源种质的鉴定、小麦异染色体系尤其是小片段易位系的选择[7]以及分子标记辅助选择育种[8]。偃麦草染色体包含大量的抗性和品质相关基因，基于基因组开发特异分子标记，将极大促进偃麦草优异性状的发掘、鉴定与利用，加快小麦抗性育种进程。

1 几种重要偃麦草的特异标记开发现状

1.1 长穗偃麦草标记

长穗偃麦草（Th.elongatum（Host）D.R Dewey）与小麦亲缘关系较近，E基因组与小麦A，B，D基因组的遗传分化程度较小。长穗偃麦草通常有二倍体、四倍体、十倍体3种类型，二倍体长穗偃麦草的Ee基因组是该物种的基本基因组，也有人认为存在六倍体长穗偃麦草[9]。长穗偃麦草基因组中蕴含着丰富的抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱等优良基因，其染色体7EL或7ES上[10]、1E[11]染色体臂上发现了抗赤霉病基因，它是提高小麦生物和非生物胁迫耐受性的一个重要的潜在基因供体。基于其诸多优良性状，因此，较早地育成了一套完整的小麦-长穗偃麦草二体附加系和代换系。

早在1998年，刘树兵等[9]已经通过长穗偃麦草与普通小麦间的多态性及E组染色体的特异RAPD标记研究中，以中国春、长穗偃麦草及其7个二体附加系为材料，获得了3个长穗偃麦草染色体特异RAPD标记OPE-051300，OPF-03700和OPF-15400，分别位于1E和3E染色体上。尤明山等[5]用40对小麦SSR引物对17份偃麦草、2份小麦材料PCR扩增分析后，筛选到Xgwm325-100 bp是Ee染色体组的特异SSR标记。陈国跃等[12]首次获得了一套完整的分子标记。张超[13]利用11条引物，共获得除2E外分布于其余6条长穗偃麦草染色体特异片段74条，其中，1E，3E，4E，5E，6E，7E分别为7，7，15，19，9，17条。3类引物组合为ISSR，IRAP和REMAP等3种类型，并将位于5E以及7E染色体上的共3个E染色体特异片段转换为特异PCR标记。朱雪[14]用11条引物，共获得45条特异片段，分布于长穗偃麦草6条染色体（除2E）上，其中，1E，3E，4E，5E，6E，7E分别有6，3，8，11，8，9条，这些条带属于ISSR，IRAP和REMAP等3种类型。并将位于1E（Z34-IE200），4E（Z8-4E374），6E（Z17-6E199）以及7E（Z31-7E215）染色体上的4个特异片段转换为SCAR标记。葛江燕等[15]基于抑制消减杂交（SSH）筛选出36个长穗偃麦草特异分子标记。陈士强等[16]基于SLAF-seq技术，共开发了48个长穗偃麦草特异分子标记，基因组特异分子标记2个，1E染色体特异分子标记20个，其他染色体的特异标记26个，包括17个仅出现在1E和5E染色体上。秦树文等[17]依据TRAP技术，获得30个长穗偃麦草特异SCAR标记，其中具有单条、2条和全基因组染色体特异SCAR标记个数分别为18，9，3个。CHEN等[18]根据逆转录酶以及大麦BARE-1和水稻RIRE-1中的长末端重复序列保守区域设计的11个引物组合，得到145个分布在长穗偃麦草的全部7条E染色体上的ISSR，IRAP，REMAP等3种类型的特异性片段。经与小麦序列同源性比对后，将其中13个长穗偃麦草特异染色体标记然后转换成SCAR标记。

1.2 百萨偃麦草标记

百萨偃麦草（Th.bessarabicum Löve，2n＝2X＝14）为海岸禾草，多生长于欧洲波罗的海和地中海沿岸。百萨偃麦草除抗小麦梭条花叶病、赤霉病、线虫等，还具有耐盐、耐铜、耐铝、耐重金属等优良性状[19]。目前，研究最多的是它的耐盐性。人们首先合成了普通小麦中国春-百萨偃麦草双二倍体（2n＝8X＝56），简称为Tritipyrum，以期转移和利用其耐盐基因，又相继获得异附加系、异代换系、易位系等小麦亲缘物种的异染色体系[20]。

KING等[21]获得了5J染色体上10个特异RAPD标记，利用基因组原位杂交法，将其中6个定位在短臂上，4个定位在长臂上。ZHANG等[6]筛选出一套中国春-百萨偃麦草二体附加系的AFLP和RAPD标记，并利用GISH技术证实，其中48，67，39，59，54个AFLP标记分别可以追踪1J，2J，4J，5J和7J染色体。陈华锋等[20]筛选出30个特异分子标记可追踪百萨偃麦草染色质，其中可以特异追踪CH05，CH09和CH03等二体附加系中的百萨偃麦草染色体的特异分子标记5，4，2个，同时筛选出3个标记可以特异追踪CH12和CH11中的易位染色体，还筛选出5个STS，3个RFLP探针和5个SSR共13个标记，并推断可以特异追踪4J，5J染色体。达瓦顿珠[22]利用一套中国春-百萨偃麦草附加系，筛选出2个4J染色体特异标记，XZ564和Xwmc233，且将其初步定位在4JS；筛选出8个5J染色体特异标记，根据8个标记在单体附加系MA5J自交后代的扩增结果分析，推断其中的一个标记Xedm46位于5JL，其他7个标记位于5JS。同时还筛选4个特异标记能追踪百萨偃麦草其他染色体，能特异追踪1J的标记为XZ507，XZ505，XZ476，能特异追踪7J的标记为Xedm144。李晨旭等[23]结合RNA-seq技术，通过其EST-PCR产物在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析，共定位了198个百萨偃麦草特异标记，分别位于染色体1J（31），2JS（15），2JL（26），3JS（20），4JS（12），4JL（12），5J（27），6JS（13），6JL（22）和7JS（20）上。

1.3 中间偃麦草标记

中间偃麦草（Th.intermedium，2n＝6X＝42）是个部分同源-异源六倍体物种，其中，2个染色体组可能源于二倍体百萨偃麦草（Th.bessarabicum，2n＝2X＝14，EbEb）和二倍体长穗偃麦草（Th.elongatum，2n＝2X＝14，EeEe）；另外一个染色体组原始供体可能为拟鹅观草（Pseudoroegneiria strigosa，2n＝4X＝28，StStStSt），与小麦亲缘关系较远。一般将中间偃麦草染色体组构成表示为EeEeEbEbStSt或者JJJSJSStSt[24]。中间偃麦草对小麦白粉病、锈病、黑穗病、根腐病、黄矮、叶枯病、条纹花叶病和赤霉病等多种病害免疫或高抗，因其生命力强，适应性广，分布于世界上诸多国家，是偃麦草属中最早与小麦杂交成功的近缘物种[25]。迄今，已经选育出多个小麦-中间偃麦草异附加系、异代换系和易位系[4，26]。

尤明山等[27]筛选到一个中间偃麦草染色体组特异标记，并将该标记进一步转化为偃麦草染色体SCAR标记。张增艳等[28]获得了中间偃麦草St染色体组特异RAPD和SCAR标记。崔志富等[7]在中间偃麦草2Ai-2染色体的短臂上定位到抗黄矮病基因，将3个RFLP探针序列转化为STS126，STS131和STS112标记可用于追踪2Ai-2染色体。崔雨等[29]利用RNA-seq技术设计EST-SSR引物，对普通小麦、中间偃麦草及其基因组供体二倍体长穗偃麦草、百萨偃麦草、假鹅观草进行扩增分析，从而筛选鉴定出中间偃麦草基因组特异标记。

2 偃麦草属特异分子标记的应用

迄今为转移普通小麦野生近缘种属的优良基因，通过远缘杂交及染色体工程技术，已完成了普通小麦与10多个近缘属、80多个种的远缘杂交[19]。偃麦草作为其中一个重要野生近缘种，从中发掘、转移和利用诸多优良基因，从而改良小麦品种，拓宽小麦遗传基础[4，26]。常规上通过对远缘杂交后代进行选择，获得具有目标性状的小麦单株，该方法难度大、周期长。而凭借DNA分子标记不但可以检测外源遗传物质的存在与否以及外源种质资源的多样性，而且利用遗传群体还能明确分子标记与外源基因的连锁关系，大大提高了选择准确度和育种效率[30]。KING等[21]结合GISH技术，利用RAPD鉴定出5JL和5JS端体附加系、5AS·5JL易位系等。王瑞晶等[31]依据偃麦草EST序列中SSR的总体特征，获得了64个具有多态性的偃麦草EST-SSR标记，其结果可应用于偃麦草重要性状关联分析、遗传多样性研究分析。闫红飞等[32]对来源于长穗偃麦草的小麦抗叶锈基因Lr19开发分子标记，建立了与Lr19共分离的稳定的SCAR标记Y19SCAR982，对120个小麦品种检测的结果表明，该标记可有效应用于小麦抗叶锈分子辅助选择育种。

3 问题与展望

目前，国内外开展了大量小麦与近缘种属的远缘杂交工作，获得了许多异源附加系、代换系和易位系，由于当前基因组原位杂交（GISH）等细胞学技术在跟踪检测外源遗传物质方面存在一定的局限性，限制了上述材料的深度利用。因此，发展快速、有效的检测技术，有助于推动远缘杂交、染色体工程育种的发展，同时在小麦种质资源的创制与鉴定上意义深远。当前小麦和偃麦草基因组的全序列结果未公开，加之小麦和偃麦草的基因组序列的同源性较高，利用AFLP，RFLP，RGAP，SSR和RAPD标记技术开发的一些偃麦草特异分子标记普遍存在成本高、周期长、效率低、稳定性低、重复性和特异性不强等缺点[33]。同样是二倍体长穗偃麦草染色体1E-7E特异标记，用42个RGAP引物组合扩增共获得特异RGAP标记30个[12]，用5对AFLP引物组合扩增共获得AFLP标记28个[34]，在效率上有所提高，但是转化成STS标记的只有4个[15]。因此，高效利用偃麦草优良性状的关键是开发新的操作简单、快速、经济和有效的分子标记。

TRAP技术[17]与RAPD，SSH，AFLP，SLAF-seq比较，其优势在于设计引物不是随机的，是依据已有EST序列利用引物设计软件所得，同时最终的多态性标记与表现型的相关性相对较高。同时利用TRAP技术开发的长穗偃麦草特异SCAR标记，具有特异性强、稳定性好、扩增结果简明易读的特点，可用于小麦背景中不同材料和不同世代中长穗偃麦草染色体的跟踪和鉴定[17]。RNA-seq技术是以数字化信号检测物种的整体转录活动，同时还具有成本低、周期短、高通量等优势，为快速开发亲缘物种特异分子标记提供了丰富的序列信息，是目前开发大量特异分子标记的有效工具，这一技术在分子标记开发和分子机理研究方面应用越来越广泛。目前一项利用RNA-seq技术开发的百萨偃麦草特异标记的研究中，得到的标记在鉴定小麦-百萨偃麦草小片段易位系或渐渗系、染色体物理作图中具有很大的应用潜力[23]。

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Research Progress of Molecular Markers Development inThinopyrum

ZHUYan1，CHANGZhijian2，ZHANGXiaojun2，LI Xin2，ZHANHaixian2，GUOHuijuan2，QIAOLinyi2
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Taiyuan 030031，China）

Thinopyrum has manyexcellent traits,such as high quality,disease resistance and salinity,which are urgentlyneeded in wheat breeding.To fully exploit the potential of Thinopyrum in improving the quality and resistance of wheat,the paper enumerates the development of specific molecular markers for three kinds of Thinopyrum,the paper expounds its application in wheat breeding,and analyzes the existingproblems about the development technologyfor Thinopyrum,soas topromote the Thinopyrum molecular markers for be better applyingin the genetic breedingofwheat.

Thinopyrum;breedingapplication;marker development

Q943.2

A

1002-2481（2017）04-0659-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.41

2016-12-01

国家重点研发计划项目（2016YFD0102004-07）；山西省青年基金项目（2015021145）；山西省自然科学基金项目（20150311001-1）；山西省国际合作项目（201603D421003）；山西省农业科学院攻关项目（15YGG01，YGG1602）

朱艳（1992-），女，山西朔州人，在读硕士，研究方向：种质资源创新与利用。乔麟轶为通信作者。