正交试验优选槐角总黄酮的提取工艺及不同产地的含量测定*

庞璐阳 潘五九 王伟明

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

槐角Fructus sophorae 为豆科植物槐Sophora japonica L．的果实，多用于肠热便血、痔肿出血，肝热头痛、眩晕目赤［1］的治疗，随着研究的逐步深入，近年来发现槐角中的黄酮类化合物多达27种，种类和含量多于银杏仁，异黄酮总含量高达29.58g·kg-1，是大豆的18倍［2］，鉴于异黄酮类化合物具有雌激素样活性，本课题研究出了一种槐角新药，专门治疗女性泌尿生殖道萎缩的栓剂，可避免长期应用化学雌激素药物的致癌风险［3］；黄酮类化合物具有降血压、抗生育和抗癌等药理作用。基于此并参照相关文献［4-5］采用正交试验设计法，优选槐角中总黄酮的最佳提取工艺，为新药的制备提供参考。

1　实验仪器与材料

1.1　仪器

紫外可见分光光度计（Lambda 563，PerkinElmer）电子天平（BSA224S-CW，德国奥多利斯）sartorius电子分析天平（BP211D，德国奥多利斯）超声波清洗器（KQ-300DB，昆山市超声仪器有限公司）电子恒温水浴锅（HWS26型，上海-恒科技有限公司）

1.2　材料

芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200707）槐角药材均由专业人员采购，并经我院王伟明研究员鉴定为槐角药材。

2　方法与结果

2.1　紫外分光光度法测定

2.1.1标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品5.31mg，用60%乙醇定容于25mL容量瓶，浓度为0.531mg·mL-1的标准溶液。分别精密吸取0.20，0.40，0.60，0.801.00，1.20，1.40，1.60mL标准溶液于10mL容量瓶，分别加入1.80，1.601.40，1.20，1.00，0.80，0.60，0.40依次加入0.50mL的5%NaNO3溶液，0.50mL的10%Al(NO3)3溶液，4.00mL的4%NaOH溶液，每次添加中静置6min，最后用60%乙醇定容，15min后进行测量。对溶液进行全波长扫描，在520nm处有最大吸收波长。

2.1.2标准曲线 以吸光度Y对浓度X进行线性回归，标准曲线方程为Y=11.364X+0.0214，R=0.9997，线性范围为 0.01062-0.08496mg·mL-1。见图2-1。

图2-1 总黄酮标准曲线Fig.2-1 The standard curve of flavonoids

2.2　提取条件的选择

2.2.1单因素考察

2.2.1.1提取方法的选择精确称取槐角粉末1.00g，选取70%乙醇溶液、料液比1:10（W/V），1.0h，提取1次，考察超声波提取法，乙醇回流法对提取总黄酮含量的影响。提取液过滤，浓缩蒸干，用70%乙醇定容于10mL容量瓶。采用亚硝酸钠显色法在紫外可见分光光度计下测定溶液吸光度值，计算总黄酮含量及提取率。结果见表2-1，由此可知水浴回流法提取率高于超声波提取法，故选取水浴回流法为提取方法。

表2-1 不同提取方法的总黄酮提取率Tab.2-1 The yield of flavonoids with different extraction processes

2.2.1.2提取次数的选择 精确称取槐角粉末1.00g，选取70%乙醇溶液、料液比1:10（W/V），水浴回流法提取1.0h，考察提取1次，2次，3次对提取总黄酮含量的影响。提取液过滤，滤液合并，浓缩蒸干，用70%乙醇定容于10mL容量瓶。采用亚硝酸钠显色法在紫外可见分光光度计下测定溶液吸光度值，计算总黄酮含量及提取率。结果见表2-2，由此可知，提取3次提取率高于其他的提取次数，故选取3次为提取次数。

表2-2 不同提取次数的总黄酮提取率Tab.2-2 The yields of flavonoids with different extraction times

2.2.2总黄酮提取工艺正交试验 采用正交试验方法，优化总黄酮提取工艺。选择不同溶剂浓度、料液比、提取时间，进行三因素三水平的正交试验。试验因素表如下。

表2-3 L9（33）因素水平表Table 2-3 L9（33）factor levels

采用亚硝酸钠显色法在紫外可见分光光度计下测定溶液吸光度值，计算总黄酮含量及提取率，结果见表2-4。方差分析见表2-5。

表2-4 总黄酮提取工艺正交结果表Table2-4 Resultand analysis of flavonoids extraction process in orthoganol test

L9（33）正交试验结果421210.95627.39%522111.29228.23%623310.10025.28%731310.94027.35%832111.38028.45%933211.36428.41%K126.7625.9726.62 K226.9728.8528.55 K328.0726.9826.63 R 1.312.881.93

表 2-5 正交结果方差分析表Tab.2-5 variance analysis of orthogonal results

由此可以得出，各因素对槐角总黄酮提取率影响大小的顺序为B＞C＞A，因素B提取时间的水平改变对提取率的影响具有显著的影响，其最佳水平组合为B2C2A3，按此工艺进行验证试验结果为总黄酮提取率为33.203%，大于正交试验中的任一结果，故槐角总黄酮提取最佳工艺为：以70%乙醇溶液为提取剂，料液比为1:10（W/V），水浴回流法提取3次，每次60min。

2.3　验证试验

为进一步确定优化工艺的可靠性，选取3份药材，每份20g，按照上述筛选最佳工艺B2C2A3进行提取，测定方法同上。结果见表2-9。结果表明此最佳工艺合理，并且也具有稳定性。

表2-5 验证结果Tab2-5 Verification results

2.4　不同产地总黄酮的含量测定

2.4.1药材来源 选取河北唐山、北京、新疆、辽宁大连四个产地的为测试样品。

2.4.2总黄酮的含量测定 依据上述筛查的最佳提取工艺进行槐角药材总黄酮的提取，并且按照相同的方法进行总黄酮的含量测定，结果如下表2-6.

表2-6 不同产地槐角总黄酮含量Tab2-10 The content of total flavonoids in Sophora japonica from different habitats

2.5　结论

（1）通过正交试验最终确定槐角总黄酮最佳提取工艺为：以70%乙醇溶液为提取剂，料液比为1:10（W/V），水浴回流法提取3次，每次60min。（2）本实验在提取溶剂的选择上，主要选取的是实验室易得、成本低且毒副作用小的乙醇，考察不同浓度对槐角总黄酮提取率的影响。该工艺符合工业化生产要求，为开发槐角新药奠定了基础。（3）通过测定不同产地的槐角总黄酮含量可知河北的最优，北京的最差，这可能是由于当地的土壤条件，土质酸碱性、气候条件有关，但这也有待进一步研究分析。

[1] ChP(中国药典)[S].2015.VolⅠ(一部):560.

[2] 陈翔，郑国平，于治国.一测多评法测定槐角中异黄酮类成分的含量[J].药物分析杂志，2013，33(11):1904-1909.

[3] 王伟明，潘五九.一种治疗女性泌尿生殖道萎缩的栓剂及其制备方法:中国，CN201610915612.2[p].2017-03-08.

[4] 韦华梅，闫腾蛟，林宣沛，王剑波，等.正交试验优选槐角总黄酮的提取工艺及不同来源槐角中总黄酮的含量测定[J].陕西中医，2011，32（9）：1231-1233.

[5] 张芸兰，王文渊，等.正交设计法优选杜鹃花中总黄酮的提取工艺[J].广州化工，2009，37（3）：134-138.