盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌的体外药敏实验研究

石庆新　吕小萍　於青峰　杨阳

[摘要] 目的 探讨盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CPA）体外抗菌活性的影响。方法 实验采用肉汤稀释法测定盐酸小檗碱和亚胺培南耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌最小抑菌浓度（MIC）；采用棋盘稀释法测定盐酸小檗碱联合亚胺培南对CPA的MIC，并计算联合指数（FIC）。 结果 盐酸小檗碱和亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC的算术均数分为268.80 μg/mL和8.93 μg/mL。用亚胺培南与盐酸小檗碱联合作用后，盐酸小檗碱与亚胺培南MIC的算术均数分别降至8.16 μg/mL和4.50 μg/mL。两种药物联合使用对6.7%的60株CPA有协同的抗菌作用，对88.3%CPA呈现相加作用，对5.0%CPA呈现无关作用，无拮抗作用。 结论 盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用可以增加两者对CPA抗菌作用的敏感性。

[关键词] 盐酸小檗碱；铜绿假单胞菌；协同作用；碳青霉烯酶；亚胺培南

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）01-0114-04

铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，也是医院院内感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、败血症、伤口感染、尿路感染等，近年来其分离率和耐药率都不断的呈上升趋势[2]。根据2013年全国细菌耐药监测数据，铜绿假单胞菌对碳青霉稀类的耐药率达到25%以上，且出现了广泛耐药菌株[3]。铜绿假单胞菌对抗菌药物耐药形势非常严峻，给临床治疗带来了难题。

盐酸小渠碱是中药黄连提取物，也是一种生物碱，《中国药典》记载黄连和盐酸小檗碱具有抗菌消炎等药理作用[4]。有关盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌作用研究很少。本实验拟通过盐酸小檗碱和亚胺培南的体外联合药敏试验研究，评价两种药物的联合用药的抗菌效果。为临床治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌“超级细菌” 提供实验依据和新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期间，从台州恩泽医院和台州路桥医院住院患者中各分离40株和60株CPA（剔除重复分离菌株）。100株临床菌株通过法国梅里埃VITEK2-CompactT检测，然后通过Hodge实验[5]确认筛选出耐碳氢酶烯类铜绿假单胞菌60株。质控菌株27853购于中国卫生部临检中心。

1.1.2 抗菌药物 盐酸小檗碱分析标准品批号为160528，纯度98%，规格1 g/支；亚胺培南批号为160421，纯度98%，规格5 g/支，购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 实验前将所有保存菌种经复融、转种、分离培养，在同一平板上取性状相似1～2个菌落，接种到LB液体培养基内10～12 h。再用 RPMI1640液体培养基调节细菌LB培养液使其密度为2～6×108 CFU/L 菌悬液备用。实验时再将备用菌悬液用RPMI1640培养基稀释到100倍，最终密度为2～6×106 CFU/L接种菌悬液。

1.2.2 药物浓度的配制 先用无菌蒸馏水把盐酸小檗碱和亚胺培南干粉碱分别配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素药敏微量稀释原理：盐酸小檗碱起始浓度为2048 μg/ml，第1孔的浓度为2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀释对药物进行倍比稀释，稀释到第10管孔浓度为2 μg/mL，得到的盐酸小檗碱的浓度范围在2～1024 μg/mL之间。亚胺培南起始浓度为256 μg/mL，用同样的方法稀释最终得到亚胺培南的浓度范围在0.125～128 μg/mL之间。

1.2.3 盐酸小檗碱和亚胺培南单独药敏试验 根据NCCLS微量倍比稀释原理在96孔的V型检测板加入药敏原液并稀释至第10孔为最低检测浓度的2倍，然后再第1孔至第11孔加入50 μL稀释好的菌懸液，使最终每孔菌液浓度为l×105 CFU/mL，第11孔为不加细菌的对照孔，第12孔为空白对照孔。然后混匀加盖置37℃孵育箱，18～24 h后观察结果。

1.2.4 盐酸小檗碱交叉联合抗真菌药物药敏试验 采用棋盘微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍浓度，两种药物稀释分别在96孔培养板上按横和纵两列进行联合[7]。接种菌量为1×105 CFU/mL，铜绿假单胞菌分别于37℃孵育18～24 h后观察细菌生长情况。用部分抑菌浓度指数（FIC）作为评价联合药敏试验效果。

1.2.5 FIC的计算及判定标准[6] FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用结果判断：①FIC指数≤0.5判定甲乙两药为协同作用；②0.52判定甲乙两药为拮抗作用。

2 结果

2.1 单药作用

盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC范围为256～512 μg/mL，MIC几何均值为265.02 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC范围为8～32 μg/mL MIC几何均值为8.57 μg/mL。

2.2 联合用药

两种药物联合使用时，盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC减至为2～32 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC减至为2～16 μg/mL见表1。两种药物对6.7%的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同的抗菌作用，88.3%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现相加作用，对5.0%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现无关作用，无拮抗作用，见表1。

2.3 亚胺培南与盐酸小檗碱单独使用和联合使用情况下MIC比较

亚胺培南单独使用和其与盐酸小檗碱联合使用时MIC值的比较采用t检验，两者存在显著性差异（t=15.11，P=0.00<0.01）。同样盐酸小檗碱单独使用和其与亚胺培南联合使用时的MIC值比较，存在显著性差异（t=36.18，P=0.00<0.01）。见表2。

3 讨论

铜绿假单胞菌是革兰阴性非发酵菌，存在正常人的皮肤、肠道和呼吸道等部位。随着抗生素不合理使用及广泛使用，铜绿假单胞菌对抗菌药物耐药率也不断上升，对多种耐药甚至几乎全部抗生素耐药，这给治疗铜绿假单胞菌所致感染带来了巨大的挑战，使其成为所谓的“超级细菌”[8]。本课题从中西药联合使用的角度探索治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌方法。

从结果来看，用微量稀释法检测耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对亚胺培南的MIC均值为8.93 μg/mL，此结果与仪器法检测的MIC范围是一致，其判断标准严格按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）药敏试验的标准[9]。中药提取物盐酸小檗碱对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌也具有抗菌作用，单独使用时其MIC的浓度为268.80 μg/mL。这个浓度比Sun Y等[10]的实验结果偏高。可能是因为我们实验组选择的菌株耐药性与他们实验组不同；他们实验的菌株是普通铜绿假单胞菌，而我们组选择的菌株全都是耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌。目前本文认为铜绿假单胞菌耐碳氢酶烯类机制有以下几点：（1）产金属酶，其可以水解碳氢酶烯类和所有β-内酰胺类抗生素，并且不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制[11]，通过染色体和质粒介导耐药基因，主要在铜绿假单胞菌和其他非发酵菌之间传播。其基因分型分为GIM型1、VIM、 SPM、IMP等，在我国临床分离的耐药菌株以VIM、IMP基因型为主[12，13]。（2）药物作用靶位的改变：β-内胺类抗菌药物与细菌细胞膜上特定靶位相结合后，抑制细菌细胞壁肽聚糖分子合成，导致细菌溶解死亡。在对临床分离亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌株中，发现细菌耐药性与青霉素结合蛋白的改变关系密切，与细胞膜通透性改变呈协同作用[14]。（3）外排系统耐药是外膜蛋白形成了主动外排系统，开口于外膜的复合物，可以直接使药物泵出到细菌体外。当其表达增高时导致耐药，目前发现7种主动外排系统，均属于RND家族，Mexab-OprM是在铜绿假单胞菌中最先发现RND家族外排系统，其作用的底物广泛，最有临床意义的药物外排系统[15]。（4）膜的通透性降低：铜绿假单胞菌的细胞膜就有分子筛作用，阻止抗菌药物进入到细胞内。大多数抗菌药物根据分子量的大小通过膜孔蛋白通道进入到细胞。铜绿假单胞菌中与碳青霉碳青霉烯类药物相关的膜孔蛋白少，OprD是目前研究发现引起碳青霉烯类抗生素耐药膜孔蛋白。OprD膜孔蛋白表达缺失或下调是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一[11]。如果临床分离到耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌，通常对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、β-内酰胺酶抑制剂类、氨基糖苷类类等药物呈现协同耐药[16]，临床医生对此束手无策，到无药可用的境地，进而导致患者死亡率增高，就需要寻找新的治疗药物和新的治疗方案。

本实验数据表明两种药物联合使用的情况下，亚胺培南的药物浓度平均降低原来的一半，盐酸小檗碱的药物浓度从268.80 μg/mL平均降到8.16 μg/mL，根据检验的结果两药联合使用与两药单独使用存在显著性差异，西药亚胺培南和中药盐酸小檗碱联合使用对95%的耐药菌株具有较理想的抑菌效果；能够增强彼此的抗菌能力。在谭黎明等[17]研究中说明黄连提取物分别与氨苄西林和头孢他啶联合使用可以降低病人血液培养阳性率；黄连提取物可以提高氨苄青霉素和头孢菌素治疗大鼠铜绿假单胞菌感染的疗效。这与本实验结果基本相一致，盐酸小渠碱与药物合用可以提高药物的疗效，与单用抗生素组比较，差异有显著性（P<0.01）。同样在丁彩云等[18]的头孢哌酮舒巴坦与小檗碱合用治疗福氏志贺菌痢疾50例研究中也说明这一观点，头孢哌酮舒巴坦与盐酸小檗碱合用治療有效率为100%，显著高于单用头孢哌酮舒巴坦的70%。盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抑菌或者杀菌机制是通过增加细胞膜的通透性[19]，当细菌的细胞膜通透性增加时，抗菌药物就比较容易通过细胞膜进入细胞内，抗菌效能增加，药物MIC就会降低。碳青霉烯类药物和盐酸小檗碱合用时，其MIC也会降低，与本实验相符。

综上，盐酸小檗碱与亚胺培南联合使用抑制铜绿假单胞菌的能力明显高于单独使用盐酸小檗碱或亚胺培南药物。为临床治疗耐碳青霉烯铜绿假单胞菌提供理论依据。盐酸小檗碱除了增加细胞膜的通透性以外，可能存在其他的抗菌机制，还有待进一步研究证实。

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（收稿日期：2016-10-21）