青霉素敏感携带blaZ基因金黄色葡萄球菌几种表型检测方法比较

朱卫金，潘美珍，张丽娜

(常州市中医医院检验科，江苏常州 213000)

青霉素敏感携带blaZ基因金黄色葡萄球菌几种表型检测方法比较

朱卫金，潘美珍，张丽娜

(常州市中医医院检验科，江苏常州 213000)

目的 评估“四叶草”试验、K-B纸片法、头孢硝噻吩显色法、青霉素抑菌圈边缘试验4种方法检测青霉素敏感金黄色葡萄球菌blaZβ-内酰胺酶基因的能力。方法 以PCR法扩增blaZβ-内酰胺酶基因为标准，评估“四叶草”试验、K-B纸片法、头孢硝噻吩显色法、青霉素抑菌圈边缘试验4种方法检测28株青霉素最低抑菌浓度(MIC)≤0.12 μg/mL的金黄色葡萄球菌中产酶株的能力。结果 28株菌株经PCR法扩增出7株blaZ阳性株，经“四叶草”试验、头孢硝噻吩显色法和青霉素抑菌圈边缘试验分别检出5株、2株和3株，检出率分别为17.86%、7.14%和10.71%；21株blaZ阴性菌株经上述试验检测均为阴性。K-B纸片法抑菌圈直径均≥29 mm，blaZ阳性株平均直径32.43 mm(范围29～35 mm)，blaZ阴性株平均直径38.81 mm(范围32～45 mm)，两者差异有统计学意义(t=4.58，P<0.05)。结论 检测金黄色葡萄球菌是否对青霉素敏感的常规表型测试法结果不完全可靠。

青霉素；金黄色葡萄球菌；β-内酰胺酶；blaZ

目前从人体感染部位分离的金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率已经超过了90%[1]。临床常规药敏试验方法比如纸片扩散法、仪器法等检出的金黄色葡萄球菌对青霉素的试验结果不完全准确，其中携带blaZ基因的菌株有可能被报告成敏感，易造成临床用药的误区。为探索这一问题，本研究用PCR法扩增blaZ基因结果为标准，比较实验室常用的几种表型检测方法的优劣。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集常州市中医医院2011年1月至2016年6月临床分离的经Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪及配套GP67板卡检测青霉素最低抑菌浓度(MIC)≤0.12 μg/mL的非重复金黄色葡萄球菌 28株，其中分泌物21株，腹腔引流液5株，痰液2株。金黄色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 29213为本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器 Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪及配套GP67卡、M-H 培养基(法国生物梅里埃公司)；青霉素药敏纸片(10 U)、头孢硝噻吩纸片(Oxoid公司)；ABI 7500 PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)；凝胶成像仪和电泳仪(美国Bio-Rad公司)；2×Taq Master Mix和DNA marker(大连宝生物工程公司)；琼脂糖(上海生工生物公司)；引物由上海生工生物公司合成。

1.3blaZ基因检测 采用加热煮沸法提取菌株DNA作为PCR模板。参照文献[2]合成blaZ基因引物，上游引物5′-CAAAGATGATATAGTTGCTTATT

CTCC-3′，下游引物5′-TGCTTGACCACTTTTATCAGC-3′，扩增产物长度为421 bp。总体系50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2× Taq Master Mix 25 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。循环参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。ATCC 25923和ATCC 29213分别作为blaZ基因扩增中的阴、阳性对照。PCR扩增阳性产物由上海生工公司进行双向测序，测序结果经BLAST比对分析以确定基因型。

1.4 “四叶草”试验[2]调节金黄色葡萄球菌ATCC 25923至0.5麦氏浊度单位，均匀涂布M-H琼脂平板，在平板中央贴上10 U青霉素纸片，用接种环挑取待测菌自纸片边缘向平板边缘划线接种。35 ℃培养16～18 h后观察结果，若青霉素抑菌圈处出现矢状生长则提示待测菌产β-内酰胺酶。金黄色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分别作为阴、阳性对照。

1.5 K-B纸片法检测及抑菌圈边缘试验 采用K-B法，按照CLSI M100-26[3]，待测菌株用生理盐水调成0.5麦氏浊度单位均匀涂布于M-H琼脂平板，并在平板中央贴10 U青霉素纸片，置于35 ℃培养16～18 h，游标卡尺记录青霉素抑菌圈直径。由3名经验丰富的微生物工作者观察上述测试青霉素纸片抑菌圈边缘，呈光滑“绝壁样”提示产β-内酰胺酶，若边缘呈模糊“海滩样”则提示不产β-内酰胺酶。金黄色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分别作为K-B法的阴、阳性质控菌株。

1.6 头孢硝噻吩显色法 参照纸片说明书，用一滴无菌去离子水将头孢硝噻吩纸片浸湿，取青霉素抑菌圈边缘细菌直接涂布于湿润的纸片上，观察纸片颜色，若1 h内纸片由黄变红为阳性，若不变色为阴性。金黄色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分别作为阴、阳性质控。

1.7 统计学分析 用SPSS 22.0软件进行。blaZ阳性组和blaZ阴性组青霉素抑菌圈直径大小比较采用t检验。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 基因检测结果 28株金黄色葡萄球菌中，blaZ阳性7株，blaZ阴性21株。见图1。

注：M，DNA marker；1，金黄色葡萄球菌ATCC 29213；2～5为blaZ阳性菌株；6，金黄色葡萄球菌ATCC 25923；7、8为blaZ阴性菌株。

图1 PCR扩增blaZβ-内酰胺酶基因凝胶电泳分析

2.2 “四叶草”试验及头孢硝噻吩显色试验结果 7株blaZ阳性金黄色葡萄球菌“四叶草”试验检出5株阳性，2株阴性；头孢硝噻吩显色试验检出2株阳性，5株阴性。21株blaZ阴性株“四叶草”试验及头孢硝噻吩显色试验均阴性。2种试验的特异性均为100%。

2.3 青霉素抑菌圈直径及抑菌圈-边缘试验结果 28株菌抑菌圈直径均大于29 mm。blaZ阳性株直径范围为29～35 mm(平均32.43 mm)，blaZ阴性株为32～45 mm(平均38.81 mm)，两者差异有统计学意义(t=4.58，P<0.05)。青霉素抑菌圈边缘试验结果显示，7株blaZ阳性菌株中5株3位观察者均判为光滑型；21株blaZ阴性菌株中有3株菌同时被3位观察者认为是光滑型。

3 讨论

本研究从28株菌中扩增出7株含有blaZ基因，检出率为25%。目前，金黄色葡萄球的药敏试验大都采用仪器法，仪器检测的青霉素MIC≤0.12 μg/mL的菌株，加做头孢硝噻吩试验敏感性不高，这可能也是CLSI 2016规定需要观察青霉素纸片抑菌圈边缘的形状来判断是否真正敏感的原因。“四叶草”试验虽敏感性相对较高，但其需要培养16～18 h才能观察结果。K-B纸片扩散法优点为操作简单、方便、成本低，本试验所选的28株菌抑菌圈直径全部≥29 mm，blaZ阳性菌株与blaZ阴性菌株抑菌圈直径差异有统计学意义(P<0.05)，与Kaase等[4]的结果相同。但更改和重新界定折点还需要大量的检测数据和临床疗效观察。用Vitek 2 Compact仪器配套GP67卡检测葡萄球菌属对青霉素MIC的检测范围为0.03～0.5 μg/mL，所以不能报告超出检测范围的blaZ阳性菌株和blaZ阴性菌株对青霉素的具体MIC值，也就失去了根据MIC值推测是否存在blaZ基因的依据。抑菌圈边缘观察试验存在一定的人为误差。本次试验中3名有经验的微生物人员在7株blaZ阳性菌株中一致判定5株是边缘光滑型，与PCR法比较一致性较高(71.43%)，也是CLSI 2016推荐的方法；但仍有3株blaZ阴性菌株被3位观察者认为是边缘光滑型，通过加强操作和判断方法的培训应该可减少这种误判。对于青霉素敏感率较高的地区或患者，如基层医疗单位和社区获得性感染的患者，提前加做“四叶草”试验，可以缩短报告时间，微生物实验室可适当考虑。

[1]Chambers HF, Deleo FR. Waves of resistance:Staphylococcusaureusin the antibioticera[J]. Nat Rev Microbiol, 2009, 7(9): 629-641.

[2]El Feghaly RE, Stamm JE, Fritz SA,etal. Presence of theblaZbeta-lactamase gene in isolates ofStaphylococcusaureusthat appear penicillin susceptible by conventional phenotypic methods[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2012, 74(4): 388-393.

[3]CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-sixth informational supplement. M100-26[S]. Wayne, PA：CLSI, 2016.

[4]Kaase M, Lenga S, Friedrich S,etal. Comparison of phenotypic methods for penicillinase detection inStaphylococcusaureus[J]. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(6): 614-616.

(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.12

朱卫金，1983年生，男，硕士，主管技师，主要从事微生物检验工作。

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2016-11-16)