imCIM检测B类碳青霉烯酶的效果评价*

程阔，于宏伟，马伟立，何京，杨子轩，冯军花，张金艳

(河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050000)

·临床检验技术研究·

imCIM检测B类碳青霉烯酶的效果评价*

程阔，于宏伟，马伟立，何京，杨子轩，冯军花，张金艳

(河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050000)

目的 评价抑制剂增强改良碳青霉烯失活法(imCIM)在B类碳青霉烯酶检测中的应用价值，并与EDTA纸片增效试验(EDPT)进行比较分析。方法 收集碳青霉烯类抗生素不敏感菌株181株，其中肺炎克雷伯菌44株、大肠埃希菌44株、鲍曼不动杆菌43株、铜绿假单胞菌50株；碳青霉烯类抗生素敏感菌株83株，其中肺炎克雷伯菌25株、大肠埃希菌16株、鲍曼不动杆菌25株、铜绿假单胞菌17株。采用imCIM和EDPT对上述264株菌株进行B类碳青霉烯酶的筛查，以PCR结果作为金标准。应用一致性检验、Wilcoxon符号秩和检验、独立样本Kruskal-WallisH检验及ROC曲线进行统计学分析。结果 181株碳青霉烯类抗生素不敏感菌株中144株PCR扩增耐药基因阳性，A、B、D类碳青霉烯酶分别为39株、77株、28株；imCIM检测70株阳性，111株阴性，其中166株与PCR结果一致；EDPT检测72株阳性，109株阴性，其中134株与PCR结果一致。碳青霉烯类抗生素敏感菌株83株，PCR扩增耐药基因、imCIM及EDPT检测结果均为阴性。imCIM敏感性和特异性分别为85.71%(66/77)和97.86%(183/187)，与PCR结果一致性Kappa值为0.859；EDPT敏感性和特异性分别为66.23%(51/77)和88.77%(166/187)，Kappa值为0.561。imCIM抑菌圈差值(ΔdimCIM)与EDPT抑菌圈差值(ΔdEDPT)有差别，差异有统计学意义(Z=-6.941，P<0.05)。采用imCIM检测B类碳青霉烯酶的ΔdimCIM水平与A、D类酶ΔdimCIM总体分布位置不同，差异有统计学意义(χ2=108.887，P<0.05)。imCIM与EDPT的ROC曲线下面积分别为0.988(95% CI：0.977～0.999)和0.936(95% CI：0.909～0.963)。结论 imCIM是一种准确、高效、便捷的碳青霉烯酶表型筛选方法，敏感性、特异性较高，适合用于流行病学监测。

抑制剂增强改良碳青霉烯失活法；EDTA纸片增效试验；B类碳青霉烯酶；表型

近年来，碳青霉烯类抗生素的不合理使用导致产碳青霉烯酶菌株的暴发[1]。碳青霉烯酶分为以丝氨酸为活性位点的A、D类酶和以金属锌离子为活性位点的B类酶。他唑巴坦、硼酸等可用于抑制A类碳青霉烯酶，EDTA、吡啶酸等可用于抑制B类碳青霉烯酶[2]。CLSI M100-S27中引入改良碳青霉烯失活法(modified carbapenemase inactivation method，mCIM)，该方法利用碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类抗菌药物的原理，将美罗培南与待测菌共同孵育，孵育过程中美罗培南被破坏失去活性，不能抑制大肠埃希菌ATCC 25922生长[3]。本研究采用的抑制剂增强改良碳青霉烯失活法(inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method，imCIM)通过引入EDTA以检测B类碳青霉烯酶，同时与EDTA纸片增效试验(EDTA disc potentiation test，EDPT)对比分析，比较2种方法在检测B类碳青霉烯酶中的差异。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集河北医科大学第四医院2014年1月至2016年8月临床分离碳青霉烯类抗生素不敏感菌株181株，其中肺炎克雷伯菌44株、大肠埃希菌44株(亚胺培南或美罗培南MIC≥2 μg/mL)，鲍曼不动杆菌43株、铜绿假单胞菌50株(亚胺培南或美罗培南MIC≥8 μg/mL)。同期收集碳青霉烯类抗生素敏感菌株83株，其中肺炎克雷伯菌25株、大肠埃希菌16株(亚胺培南和美罗培南MIC≤1 μg/mL)，鲍曼不动杆菌25株、铜绿假单胞17株(亚胺培南和美罗培南MIC≤2 μg/mL)。以上菌株均为非重复分离菌株。所有受试菌株均由法国生物梅里埃Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定和药物敏感试验，并经16S rDNA测序确认[4]。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853均购自美国MicroBiologics公司。

1.2 主要仪器与试剂 胰蛋白胨大豆肉汤(trypticase soy broth，TSB)培养基(温州康泰生物公司)；EDTA、琼脂糖(上海生工公司)；M-H琼脂培养基(郑州安图生物公司)；美罗培南(10 μg)药敏纸片(英国Oxoid公司)；Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及配套GN、AST-GN09卡片(法国生物梅里埃公司)；PCR扩增仪、2×Taq PCR Master Mix(美国ABI公司)；电泳仪(法国西比亚公司)；PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 EDPT 配制0.5麦氏浊度单位待测菌菌悬液，均匀涂布于M-H琼脂培养基，将2张10 μg美罗培南药敏纸片置于其上，纸片间距不小于4 cm，其中一张纸片上加0.2 mol/L EDTA溶液10 μL，35 ℃过夜培养，若2张纸片抑菌圈直径之差(ΔdEDPT)≥5 mm则受试菌株产B类碳青霉烯酶[5]。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853作为阴性对照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146作为阳性对照。

1.4 imCIM 从35 ℃培养24 h血平板上取满1 μL接种环受试菌株，分别加入2管2 mL TSB中制成菌悬液，其中一管TSB含有0.1 mmol/L EDTA。将10 μg美罗培南药敏纸片分别浸于上述菌悬液中，35 ℃温育4 h。将0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC 25922菌悬液均匀涂布于M-H琼脂培养基上并室温放置3～10 min。将温育后的美罗培南药敏纸片取出，置于上述M-H琼脂培养基上，纸片间距不小于4 cm，35 ℃温育过夜观察。若2张纸片抑菌圈直径之差(ΔdimCIM)≥5 mm，即ΔdimCIM=d(MEM+EDTA)-d(MEM)≥5 mm则受试菌株产B类碳青霉烯酶。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853作为阴性对照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146作为阳性对照。以无菌水浸泡的美罗培南纸片作为空白对照。

1.5 PCR扩增耐药基因 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA并作为模板。参照文献[6-7]合成A类碳青霉烯酶基因blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI，B类碳青霉烯酶基因blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaGIM和D类碳青霉烯酶基因blaOXA-48、blaOXA-24、blaOXA-23，见表1，引物由上海生工公司合成。PCR扩增体系50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，模板4 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，灭菌ddH2O 17 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，Tm温度下60 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。所得产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，目的片段纯化后由上海生工公司双向测序，BLAST软件与GenBank上已公布的基因序列进行比对。

表1 耐药基因引物序列

1.6 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行。imCIM和EDPT分别与PCR行一致性检验，以Kappa值≥0.75一致性较好；计量资料不服从正态分布，数据以中位数(25分位数，75分位数)[M(P25，P75)]表示，采用Wilcoxon符号秩和检验分析imCIM与EDPT检测B类碳青霉烯酶的差异；采用独立样本 Kruskal-WallisH检验对imCIM检测A、B、D类碳青霉烯酶进行比较；采用SigmaPlot 12.5软件绘制ROC曲线，评估2种方法检出B类碳青霉烯酶的能力，曲线下面积越大检测能力越强。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药基因检测及表型筛选结果 181株碳青霉烯类抗生素不敏感菌株中144株PCR扩增耐药基因阳性，A、B、D类碳青霉烯酶分别为39株、77株、28株；83株碳青霉烯类抗生素敏感菌株PCR扩增耐药基因均为阴性。77株B类碳青霉烯酶基因阳性菌株中，imCIM阳性66株，阴性11株；EDPT阳性51株，阴性26株。在187株B类碳青霉烯酶基因阴性的菌株中，imCIM阴性183株，阳性4株；EDPT 阴性166株，阳性21株。见表2。

表2 264株受试菌株基因型、MIC、imCIM和EDPT检测结果

注：None，未检出耐药基因。

2.2 imCIM和EDPT结果分析 imCIM检测B类碳青霉烯酶敏感性和特异性分别为85.71%(66/77)和97.86%(183/187)，与PCR结果的Kappa值0.859，一致性较好；EDPT检测B类碳青霉烯酶敏感性和特异性分别为66.23%(51/77)和88.77%(166/187)，Kappa值0.561，一致性一般。

2.3 ΔdimCIM与ΔdEDPT的比较 用imCIM、EDPT分别检测B类碳青霉烯酶，ΔdimCIM和ΔdEDPT分别为20(17,21) mm和12(4,14) mm，差异有统计学意义(Z=-6.941，P<0.05)；用imCIM检测A、D类碳青霉烯酶，ΔdimCIM为0。A、B、D类碳青霉烯酶ΔdimCIM的差异有统计学意义(χ2=108.887，P<0.05)，imCIM检测B类酶ΔdimCIM水平与A、D类酶ΔdimCIM水平总体分布位置不同。

2.4 imCIM和EDPT的ROC曲线 建立ROC曲线评估imCIM、EDPT在检测B类碳青霉烯酶中的价值，见图1。结果表明2种方法检测B类碳青霉烯酶的曲线下面积分别为0.988(95% CI：0.977～0.999)和0.936(95% CI：0.909～0.963)，以0.5作为参考界值，2种方法曲线下面积均大于界值，其中imCIM的曲线下面积较大。

图1 imCIM和EDPT检测B类碳青霉烯酶ROC曲线

3 讨论

Yamda等[8]评估了改良Hodge试验(modified Hodge test，MHT)、Carba NP试验(Carba NP test，CNP)和碳青霉烯失活法(carbapenemase inactivation method，CIM)筛选产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的能力，CIM比MHT和CNP表现出较高的敏感性和特异性，在一定程度上提高了NDM、OXA型碳青霉烯酶的检出率。曹蕾等[9]和魏宏莲等[10]采用CNP和CIM分别对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌进行碳青霉烯酶检测，CIM操作简单、成本低廉、一致率高。mCIM在CIM的基础上将药敏纸片与受试菌株的温育时间由2 h延长至4 h，增强碳青霉烯酶对美罗培南的水解，确保产碳青霉烯酶菌株可被有效检出。imCIM利用EDTA可抑制B类碳青霉烯酶的特性，干扰碳青霉烯酶水解美罗培南，使其在筛查碳青霉烯酶的同时可区分产酶表型。

本研究参考Yamada等[11]以ΔdimCIM≥5 mm作为imCIM的判读标准，分别采用imCIM和EDPT检测B类碳青霉烯酶，结果imCIM的敏感性、特异性高于EDPT，Kappa值>0.75，与PCR结果一致性较高。imCIM检测A、B、D类碳青霉烯酶ΔdimCIM总体分布位置不同(P<0.05)，imCIM可有效筛选B类碳青霉烯酶。EDPT的ROC曲线下面积虽不及imCIM，但仍大于参考界值，其作为筛选产金属酶菌株的传统方法，步骤简单，操作性强，各级医院均可开展。imCIM基于稳定性高、重复性好的特点，不易受操作人员等外界因素的影响，在温育过程中使碳青霉烯酶与美罗培南、EDTA充分反应，提高了B类碳青霉烯酶的检出率，但关于imCIM的研究尚不完善，其操作步骤及判读标准有待进一步规范。

CLSI M100-S27中提出mCIM检测KPC、NDM、VIM、IMP、IMI、SPM、SME和OXA型碳青霉烯酶的敏感性和特异性均>99%，目前尚无关于非肠杆菌科细菌和其他碳青霉烯酶的调查。本研究纳入非发酵菌，包括43株鲍曼不动杆菌和50株铜绿假单胞菌，imCIM的敏感性和特异性有所降低。结果发现共有52株受试菌株imCIM、EDPT、PCR检测结果不一致，其中1株携带blaIMP基因、3株携带blaVIM基因的铜绿假单胞菌和3株携带blaNDM基因的大肠埃希菌imCIM和EDPT结果均为阴性，可能由于受试菌株同时产其他A、D类碳青霉烯酶，使ΔdimCIM和ΔdEDPT<5 mm造成漏检；3株携带blaOXA-23基因的鲍曼不动杆菌imCIM和EDPT均为阳性，可能由于本研究碳青霉烯酶基因检测尚不全面，或是作为PCR扩增模板的质粒在提取过程中部分金属酶基因丢失导致；8株携带blaNDM基因的大肠埃希菌和6株携带blaIMP基因、5株携带blaVIM基因的铜绿假单胞菌EDPT表现为阴性，可能由于受试菌株产酶量少，导致EDPT中EDTA抑制B类酶效果不明显，使ΔdEDPT<5 mm，造成假阴性。此外，EDTA对B类碳青霉烯酶的抑制存在缺陷：(1)EDTA在一定程度上抑制受试菌株的生长，或增强细菌膜的通透性导致抗生素敏感性增加，造成EDPT假阳性[12-13]，本研究中4株携带blaOXA-23基因的鲍曼不动杆菌EDPT阳性可能与此有关；(2)EDTA存在对B类碳青霉烯酶抑制不稳定的现象[14]，可能造成本研究中4株携带blaIMP基因的铜绿假单胞菌imCIM假阴性，1株携带blaKPC基因的肺炎克雷伯菌imCIM假阳性；(3)EDTA对少量ESBL、KPC、OXA-48也具有抑制作用，可导致EDPT假阳性[15]，可能与本研究中8株携带blaKPC基因的肺炎克雷伯菌、2株PCR扩增碳青霉烯酶基因阴性的大肠埃希菌、4株PCR扩增碳青霉烯酶基因阴性的铜绿假单胞菌EDPT阳性有关。与EDTA相比，吡啶二羧酸特异性高。另外，本研究中15株鲍曼不动杆菌、2株大肠埃希菌、4株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药，但PCR结果均为阴性，可能由其他机制介导耐药，如细菌高度表达ESBL或AmpC酶合并孔蛋白缺失或表达降低，主动外排系统高表达，以及碳青霉烯类抗生素作用靶位点青霉素结合蛋白(penicillin binding protein，PBP)的改变或者携带其他本研究未检测相关碳青霉烯酶基因。本课题组研究尝试了用他唑巴坦酸及硼酸来检测A类碳青霉烯酶，但敏感性较低，可能是由于他唑巴坦酸作为一种医药中间体，并不能很好地代替他唑巴坦作为酶抑制剂的功能，且他唑巴坦酸及硼酸的用量仍需进一步研究。

[1]Patel G, Bonomo RA. "Stormy waters ahead": global emergence of carbapenemases[J]. Front Microbiol, 2013, 4(11): 48.

[2]Hammoudi D, Moubareck CA, Sarkis DK. How to detect carbapenemase producers? A literature review of phenotypic and molecular methods[J]. J Microbiol Methods, 2014, 107(12): 106-118.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-seventh informational supplement[S]. M100-27. Wayne, PA: CLSI, 2017.

[4]Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA,etal. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J Bacteriol, 1991, 173(2): 697-703.

[5]严育中, 华静, 范惠清, 等. 1株泛耐药肺炎克雷伯菌耐药机制的研究[J]. 临床检验杂志, 2012, 30(6): 426-429.

[6]Pasanen T, Koskela S, Mero S,etal. Rapid molecular characterization ofAcinetobacterbaumanniiclones with rep-PCR and evaluation of carbapenemase genes by new multiplex PCR in hospital district of Helsinki and Uusimaa[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85854.

[7]Woodford N, Ellington MJ, Coelho JM,etal. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases inAcinetobacterspp[J]. Int J Antimicrob Agents, 2006, 27(4): 351-353.

[8]Yamada K, Kashiwa M, Arai K,etal. Comparison of the Modified-Hodge test, Carba NP test, and carbapenem inactivation methods screening methods for carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. J Microbiol Methods, 2016, 128: 48-51.

[9]曹蕾, 李小月, 周万青, 等. CIM和Carba NP筛选肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的比较[J].临床检验杂志, 2016, 34(9): 646-649.

[10]魏宏莲, 杨靖, 时东彦, 等. CIM和Carba NP筛选铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶比较[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(4): 241-243.

[11]Yamada K, Kashiwa M, Arai K,etal. Evaluation of the modified carbapenem inactivation method and sodium mercaptoacetate-combinationmethod for the detection of metallo-β-lactamase production by carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. J Microbiol Methods, 2017, 132: 112-115.

[12]Yong D, Lee Y, Jeong SH,etal. Evaluation of double-disk potentiation and disk potentiation tests using dipicolinic acid for detection of metallo-β-lactamase-producingPseudomonasspp. andAcinetobacterspp[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(10): 3227-3232.

[13]Denny B, West P, Panigrahi D. Effects of permeabilizers on antimicrobial susceptibility ofStenotrophomonasmaltophiliaandAcinetobacterspp[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2003, 36(1): 72-76.

[14]Teethaisong Y, Eumkeb G, Nakouti I,etal. A combined disc method with resazurin agar plate assay for early phenotypic screening of KPC, MBL and OXA-48 carbapenemases among Enterobacteriaceae[J]. J Appl Microbiol, 2016, 121(2): 408-414.

[15]Giske CG, Gezelius L, White O,etal. A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-β-lactamases and KPC inKiebsiellapneumoniaewith the use of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(4): 552-556.

(本文编辑：周万青，刘群)

Effectiveness evaluation of imCIM for detection of class B carbapenemase

CHENGKuo,YUHong-wei,MAWei-li,HEJing,YANGZi-xuan,FENGJun-hua,ZHANGJin-yan

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,Hebei,China)

Objective To evaluate the application value of inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method (imCIM) in the detection of class B carbapenemase. The differences between imCIM and EDTA disc potentiation test (EDPT) were comparatively analyzed. Methods A total of 181 strains of carbapenem insensitive strains were collected, among which there were 44 strains ofKlebsiellapneumoniae, 44 strains ofEscherichiacoli, 43 strains ofAcinetobacterbaumanniiand 50 strains ofPseudomonasaeruginosa. The 83 strains of carbapenem-sensitive strains were composed of 25 strains ofKlebsiellapneumoniae, 16 strains ofEscherichiacoli, 25 strains ofAcinetobacterbaumanniiand 17 strains ofPseudomonasaeruginosa. The class B carbapenemase in the 264 strains of pathogenic bacteria was screened by imCIM and EDPT, and PCR results were used as gold standard. The statistical analysis was performed with consistency check, related-sample Wilcoxon signed rank sum test, independent samples Kruskal-Wallis H test and ROC curve. Results Among the 181 strains of carbapenem insensitive strains, PCR results of 144 strains were positive for drug resistance gene. The samples of class A, B and D of carbapenemase were 39, 77 and 28 strains respectively. The results of imCIM showed that 70 strains were positive, and the other 111 strains were negative. The imCIM results of 166 strains were consistent with those of PCR. The results of EDPT showed that 72 strains were positive, and the other 109 strains were negative. The EDPT results of 134 strains were consistent with those of PCR. The results of PCR, EDPT and imCIM of 83 carbapenem sensitive strains were negative. The sensitivity and specificity of imCIM were 85.71% (66/77)and 97.86%(183/187), and the value of Kappa was 0.859. The sensitivity and specificity of EDPT were 66.23%(51/77) and 88.77%(166/187), and the value of Kappa was 0.561. The difference of inhibition zone of imCIM (ΔdimCIM) was different from EDPT(ΔdEDPT) and the difference was statistically significant (Z=-6.941，P<0.05). In the imCIM detection, the ΔdimCIMlevel of class B carbapenemase showed different population distribution position from class A and D carbapenemase with the statistically significant difference (χ2=108.887,P<0.05). The areas under the ROC curve of imCIM and EDPT were 0.988 (95%CI: 0.977 to 0.999) and 0.936 (95%CI: 0.909 to 0.963), respectively. Conclusion imCIM should be accurate, efficient and convenient for screening of carbapenem phenotype for its high sensitivity and specificity, and suitable for epidemiological monitoring.

inhibitor enhanced modified carbapenemase inactivation method; EDTA disc potentiation test; class B carbapenemase; phenotype

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.08

河北省卫生厅重点科技研究计划基金(20150332)。

程阔，1990年生，女，硕士研究生，研究方向：临床检验诊断学。

张金艳，主任技师，硕士研究生导师，E-mail：jinyanzhang66@163.com。

R446.5

A

2016-11-01)