全国首例子宫移植者术后他克莫司浓度和淋巴细胞亚群监测及临床意义

李蕊，杨柳，李金洁，常亮，杨静，苏明权，陈必良，马越云，郝晓柯

(第四军医大学附属西京医院a.全军临床医学检验研究所，b.妇产科，西安 710032)

全国首例子宫移植者术后他克莫司浓度和淋巴细胞亚群监测及临床意义

李蕊a，杨柳a，李金洁a，常亮a，杨静a，苏明权a，陈必良b，马越云a，郝晓柯a

(第四军医大学附属西京医院a.全军临床医学检验研究所，b.妇产科，西安 710032)

目的 探讨子宫移植后受者他克莫司血药浓度及外周血淋巴细胞亚群的变化规律，为子宫移植后免疫状态的监测提供依据。方法 采用微粒子酶免疫分析法连续检测子宫移植受者术后1年内他克莫司全血药物浓度的变化情况。全血样本同时用血液分析仪测定血液常规指标，流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群。结果 子宫移植受者术后第1个月他克莫司药物血药浓度为(13.51±3.92) ng/mL，第2个月为(15.58±1.19) ng/mL。术前淋巴细胞绝对计数处于正常水平；术后5 d外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4/CD8、NK细胞均显著减少；术后1周后淋巴细胞趋向于正常范围并维持，CD4+T淋巴细胞恢复正常时间晚于CD8+T淋巴细胞；CD4/CD8在术后10 d内，比值在0.4～0.8之间，10 d后比值上升，基本维持在0.8至1.1之间，始终低于术前水平；NK细胞在术后10 d逐渐上升，但直至术后20 d仍未恢复至术前水平；B淋巴细胞计数和百分比在术后5 d不但没有下降反而处于增高趋势，并于术后10 d之后计数和百分比逐渐恢复正常。CD3+T淋巴细胞计数与他克莫司血药浓度之间并未见明显相关性。结论 子宫移植患者淋巴细胞亚群和他克莫司药物浓度呈动态变化，但还需积累大量临床数据。

子宫移植；他克莫司；淋巴细胞亚群

同其他器官移植一样，排异反应和感染是子宫移植的两大难点。由于子宫与外界相通，感染随时可能发生，但感染与排斥反应的治疗方案却完全相悖，因此，及时识别和控制排异反应对提高子宫移植成功率具有极其重要的意义。目前，子宫移植尚无早期监测指标。常用的免疫抑制剂他克莫司(Tacrolimus，代号FK506)个体药物代谢动力学差异大，治疗剂量和中毒剂量非常接近，易出现药物不良反应，因此移植术后需进行药物浓度监测并及时调整药量，从而达到理想治疗浓度窗[1]。目前器官移植术后免疫排斥反应机制已较为明确，主要为T细胞及抗体介导的排斥反应，并以前者为主。监测受者的外周血淋巴细胞，能反映其免疫状态，故本研究对子宫移植术后送检样本测定他克莫司全血谷浓度，同步进行血常规和外周血淋巴细胞亚群测定，以期为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 对象 国内首例子宫移植受者，女，年龄23岁，先天性子宫缺失，于2015年11月20日在第四军医大学附属西京医院接受子宫移植手术，供者为患者母亲，HLA配型结果完全符合。子宫移植术后50 d出院，至今未发生排异反应，子宫存活良好，未发生排斥反应。术后采用“三联”免疫抑制剂(他克莫司+吗替麦考酚+甲泼尼龙琥珀酸钠)抗排斥方案治疗。给药方式：他克莫司、吗替麦考酚给药方式为口服，给药次数均为：每日2次，他克莫司早9：00、晚9：00各一次，吗替麦考酚早8：30、晚8：30各一次。甲泼尼龙琥珀酸钠术中及术后前4天为静脉续滴，4天后改为空腹口服，每日1次。他克莫司在50天内根据患临床表现及其他检验结果每日剂量为3 mg,上下调整1 mg；吗替麦考酚每日剂量为1.5 g；甲泼尼龙琥珀酸钠术中大剂量冲击，治疗后由静脉续滴改为口服，4 d后由60 mg开始逐渐递减。2个月后改维持剂量。

1.2 标本采集 在清晨用药前处于稳定状态时抽取乙二胺四乙酸抗凝全血，术后第1至30、35、38、41、44、47、50天以及出院后复查期内共采集标本46份。每份样本充分混匀后分成3份，分别用于他克莫司血药浓度、血常规以及淋巴细胞亚群测定。

1.3 他克莫司血药浓度测定 用美国Abbott公司IMx自动免疫分析仪及他克莫司检测试剂盒(微粒子酶免疫分析法)测定他克莫司全血谷浓度。

1.4 红细胞比容(haematocrit，Hct)测定 用Sysmex五分类自动血液分析仪进行血常规分析，溶血剂和稀释剂为该仪器配套试剂，在红细胞计数测定结果中记录Hct值。

1.5 淋巴细胞亚群测定 用BD公司FACS CantoII流式细胞仪进行淋巴细胞亚群计数，并使用FACS CantoII临床软件对结果进行分析。其中单克隆抗体和溶血素均购自美国BD公司。

1.6 统计学分析 用SPSS 17.0软件进行。数据以均数±标准差表示，相关性分析用Pearson相关系数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫移植术后不同时期他克莫司的全血谷浓度 连续监测子宫移植受者术后1年的他克莫司血药谷浓度，血药浓度基本维持在10～20 ng/mL，在15 ng/mL上下波动。术后第1个月内血药浓度为(13.51±3.92) ng/mL，第1～3个月为(13.73±3.58) ng/mL，第4～6个月为(10.64±1.24) ng/mL，第7～12个月为(8.68±0.68) ng/mL。见图1。

图1 子宫移植术后他克莫司监测浓度

2.2 移植受者术后全血样本的Hct值 在46份全血测定样本中，共有11份血样的Hct值低于25%(参考范围35%～45%)，主要集中于术后15 d内。

2.3 移植受者术后20 d内TBNK淋巴细胞亚群细胞的变化 CD3+T淋巴细胞计数和百分比在术后5 d均下降，术后10 d后逐渐恢复术前水平。CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞计数和百分比在术后均明显下降，而后逐渐恢复正常，其中CD4+T淋巴细胞恢复略慢于CD8+T淋巴细胞。NK细胞计数在术后5 d明显下降，在术后10 d起逐渐上升，但直至术后20 d仍然未恢复至术前水平。同其他两类淋巴细胞不同，B淋巴细胞计数和百分比在术后5 d不但没有下降反而处于增高趋势，在术后10 d计数达术前4倍，10 d之后计数和百分比逐渐恢复正常，见表1。

2.4 移植受者术后1年内外周血T淋巴细胞亚群监测结果 术后1周后T淋巴细胞相对计数和绝对计数迅速增高，之后逐渐恢复术前水平并维持，其中CD4+T淋巴细胞与CD3+T淋巴细胞的变化更具有同步性，见图2和图3。CD4/CD8在术后10 d内，比值在0.4～0.8之间，围绕0.6上下波动，10 d后比值上升，术后第1个月为0.87±0.21，第1～3个月为0.89±0.19，第4～6个月为1.02±0.089，第7～12个月为0.76±0.07，但始终低于术前水平，见图4。

表1 移植术后淋巴细胞亚群TBNK的变化

图2 T淋巴细胞亚群相对计数的变化

图3 T淋巴细胞亚群绝对计数的变化

图4 CD4/CD8比值的变化

2.5 全血谷浓度与CD3+淋巴细胞的相关性分析 Pearson相关性检验显示，他克莫司全血谷浓度与CD3+T淋巴细胞计数间无相关性(P>0.05)。

3 讨论

本研究采用目前肝肾移植术后常用的“三联”免疫抑制剂，从移植后1年的结果来看，患者情况良好，无排斥反应发生。2010年中华医学会器官移植学分会撰写的《他克莫司在临床肝移植中的应用指南》[2]中推荐的他克莫司目标全血浓度值如下：术后1个月内目标全血谷浓度为10～15 ng/mL，第2～3个月为7～11 ng/mL，第4～6个月后为5～8 ng/mL，并维持。中华医学会器官移植学分会撰写的《他克莫司在临床肾移植中的应用指南》[3]中推荐的他克莫司目标全血浓度值较上述更加详细：术后1个月内为6～15 ng/mL，第1～3个月8～15 ng/mL，第4～6个月7～12 ng/mL，第7～12个月5～10 ng/mL，1年以后为7～9 ng/mL。但针对于子宫移植尚未有明确的推荐治疗浓度。他克莫司的药物浓度受多种因素的影响，如个体差异、药物剂量、给药途径、疾病状态，食物与药物浓度相互作用等[4-5]。若受者为年轻健康女性，药物浓度一般高于治疗浓度；患者合用的奥美拉唑可以增加他克莫司血药谷值浓度。患者在术后11 d，食量明显增加，他克莫司浓度下降至8.4 ng/mL。所以血药浓度不能仅仅看数值，还需靠临床经验和其他辅助检查全面分析才能正确理解血药浓度的临床意义，从而制定个体化的给药方案，在免疫治疗和免疫排斥之间取得平衡。国外文献报道，器官移植者全血样本Hct值小于25%或大于45%时，用微粒子酶免疫法测定的他克莫司血药浓度会高于实际血药浓度[6]。通过测定子宫移植受者的全血样本，绝大部分样本的Hct值为25%～45%，但其中有11份血样的Hct值低于25%，并且主要来自于术者术后15 d内的标本，针对这些样本的血药浓度是否偏高还需慎重考虑。总体来说，术后他克莫司的浓度符合肝肾移植的推荐药物浓度参考范围，并且浓度更接近于肾移植的术后推荐药物浓度。

他克莫司主要抑制T细胞活化核因子(nuclear factor of activated T cell, NF-AT)等转录因子的活化而发挥抑制T淋巴细胞活化和效应的功能。他克莫司不仅抑制CD4+T淋巴细胞活化，也抑制CD8+细胞毒T淋巴细胞的产生[7]。在移植术后早期，淋巴细胞和各亚群细胞数量大大降低，可能与移植时大量失血导致的白细胞丢失和手术过程中大剂量甲泼尼龙的应用抑制体内的储存池释放白细胞有关[8]。而CD3+T淋巴细胞和CD8+淋巴细胞数量变化不同步，这可能与他克莫司对细胞毒性T细胞(CD8+CD28+亚型)有免疫抑制效应而表现为 CD8+淋巴细胞数量减少，他克莫司对CD8+CD28-亚型则有免疫调节作用而表现为CD8+淋巴细胞数量增加[9]有关。但B细胞数量反而增高，可能也是由于甲泼尼龙琥珀酸钠抑制了体内的TH1类反应，TH2类反应增强[10-12]。术后10 d，患者的各亚群淋巴细胞迅速回升，达到移植前水平。一般情况下，急性排斥在临床症状出现前1～5 d，T淋巴细胞总数和CD4/CD8比值上升，但要全面分析淋巴细胞检查结果，因为在免疫抑制过度时，CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞有可能都减少，这样CD4/CD8 比值可能反而也会上升。从术后1年的监测结果来看，CD4/CD8的值维持在0.8～1.0范围之内，能够较好地预防排斥反应以及感染的发生。

免疫抑制药物在临床应用中显示了良好的效果，但是这些免疫抑制剂均或多或少地损害了T 细胞的功能，易导致感染、恶性肿瘤的发生。对于CD4/CD8比值与排异反应之间的关系，有学者认为器官移植后CD4/CD8比值低下的患者发生排异反应反而较多[12]。一般来讲，在排斥反应发生时CD8细胞计数会升高而CD4细胞数量仍然较低。B细胞数目增高，提示机体可能由于移植后抗排异药物的应用，机体处于TH2极化状态，有利于机体建立对移植器官的免疫耐受。NK细胞百分比稍低于术前水平也与免疫抑制剂的使用有关。因此，CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞绝对值较低提示移植后患者细胞免疫功能较低，容易发生感染。研究表明，淋巴细胞计数在1 000 cell/μL以下时易发生移植后巨细胞病毒(CMV)感染， CD4+淋巴细胞计数在400 cell/μL以下时要警惕机会感染[10]。此时要紧密结合临床微生物检测结果，区分是感染和用药导致的菌群失调，建议医生合理使用抗生素。

综上所述，鉴于肝肾移植已经积累了丰富的临床经验，子宫移植也可在临床用药、治疗和围手术期的监测等方面有证可循。从初步试验结果可以看出，通过监测个体化的他克莫司血药浓度、血常规及外周血T细胞亚群的变化, 可以帮助临床更合理、更安全地使用免疫抑制剂他克莫司。同时结合受者临床表现，进行综合分析，才能更加准确地了解子宫移植受者术后的免疫状态。

[1]王旭珍, 薛武军, 田普训, 等. 他克莫司对肾移植受者外周血 NK 和 NKT 细胞比例的影响及临床意义[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(5): 533-536.

[2]中华医学会器官移植学分会. 他克莫司在临床肝移植中的应用指南[J]. 中华器官移植杂志, 2010, 31(11): 696-698.

[3]中华医学会器官移植学分会肾移植学组. 他克莫司在临床肾移植中的应用指南[J]. 中华器官移植杂志, 2010, 31(9): 565-566.

[4]付绍杰, 王彦斌, 于立新, 等. 肾移植受者他克莫司剂量/浓度个体差异影响因素及其变化规律[J]. 南方医科大学学报, 2008, 28(12): 2161-2164.

[5]韩呈武, 于雪莹, 王丽娜, 等. 北京地区健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围[J].临床检验杂志, 2009, 27(5): 390-392.

[6]Tomita T, Homma M, Yuzawa K,etal. Effects of hematocrit value on microparticle enzyme immunoassay of tacrolimus concentration in therapeutic drug monitoring[J]. Therapeutic drug monitoring, 2005, 27(1): 94-97.

[7]胡翠华, 许晓东, 刘桂芹, 等. 他可莫司对肝移植受者外周血 T 淋巴细胞亚群的影响及临床意义[J]. 中国实验诊断学, 2008, 12(12): 1562-1566.

[8]冯艳青, 陈威巍, 刘佳, 等. HBV感染者肝移植后淋巴细胞亚群变化分析[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2011, 27(7): 787-789.

[9]Aicher A, Hayden-Ledbetter M, Brady WA,etal. Characterization of human inducible costimulatorligand expression and function[J]. J Immunol, 2000, 164(9): 4689-4696.

[10]Pirenne J, Kitade H, Kawai M,etal. Regulatory cells, TH1/TH2 unbalance, and antibody-induced chronic rejection in operational tolerance induced by donor-specific blood transfusion[J]. Transplantation, 2005, 79(3): 25-27.

[11]Chen Y, Chen J, Liu Z,etal. Relationship between TH1/TH2 cytokines and immune tolerance in liver transplantation in rats[C]//Transplantation proceedings. Elsevier, 2008, 40(8): 2691-2695.

[12]沈梦, 王祥慧. 2015年ATC器官移植国际前沿热点及新进展概述[J]. 器官移植, 2016, 7(1): 14-20.

(本文编辑：刘群)

Monitoring of blood tacrolimus concentration and lymphocyte subsets in the first uterus transplant recipient in China and its clinical significance

LIRuia,YANGLiua,LIJin-jiea,CHANGLianga,YANGJinga,SUMing-quana,CHENBi-liangb,MAYue-yuna,HAOXiao-kea

(a.InstituteforClinicalLaboratoryMedicineofPLA,b.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospitalAffilicatedtotheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,Shaanxi,China)

Objective To investigate the changes of peripheral blood tacrolimus concentration and lymphocyte subsets in the uterus transplant recipient, and provide the evidence for monitoring the immune status after uterus transplantation. Methods The peripheral blood tacrolimus concentrations of the uterus transplant recipient during 1 year after transplantation were measured with the microparticle enzyme immunoassay (MEIA). Meanwhile, the whole blood cell counts and lymphocyte subsets were determined by the blood analyzer and flow cytometer, respectively. Results The blood tacrolimus concentrations of the uterus transplant recipient in the first month and second month after transplantation were (13.51±3.92) ng/mL and (15.58±1.19) ng/mL, respectively. The lymphocyte absolute counts were normal before transplantation. At the fifth day after transplantation, the counts of CD3+T lymphocytes, CD4+T lymphocytes, CD8+T lymphocytes and NK cells and the ratio of CD4/CD8 were significantly decreased. One week after transplantation, the counts of CD4+T lymphocytes were recovered to the normal range and maintained, but its recovery was slower than that of CD8+T lymphocytes. The ratio of CD4/CD8 ranged from 0.4 to 0.8 during 10 days after transplantation, and increased and maintained between 0.8 and 1.1 after that. The counts of NK cells increased gradually from the 10th day after transplantation, but still did not recover to the level before transplantation even at the 20th day after transplantation. However, the counts and percentages of B lymphocytes did not decrease but increased at the fifth day after transplantation, and recovered to normal gradually from the 10th day after transplantation. There was no significant correlation between the CD3+T lymphocyte count and blood tacrolimus concentration. Conclusion The dynamic changes of blood lymphocyte subsets and tacrolimus concentration exist in the uterus transplant recipient, which need to be further verified by a large amount of clinical data.

uterus transplantation; tacrolimus; lymphocyte subsets

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.14

李蕊，1988年生，女，硕士，技师，主要研究方向为临床实验诊断、前列腺癌发病研究。

郝晓柯，教授，博士，E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn。

R446.5

A

2016-10-30)