传统东北酸菜自然发酵过程中乳酸菌与营养物质同步分析

马欢欢，吕欣然，林洋，孙梦桐，白凤翎*，励建荣

1(渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州,121013)2(北京林业大学 生物科学与技术学院，北京,100083)

传统东北酸菜自然发酵过程中乳酸菌与营养物质同步分析

马欢欢1，吕欣然2，林洋1，孙梦桐1，白凤翎1*，励建荣1

1(渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州,121013)2(北京林业大学 生物科学与技术学院，北京,100083)

通过对传统东北酸菜发酵过程中乳酸菌数量与基质中还原糖和可溶性蛋白等营养物成分变化进行同步分析，结果表明，在5～15 ℃条件下发酵35 d进入成熟期，乳酸菌数为6.61 lg CFU/mL，比细菌数量高出1个数量级，成为优势菌群；还原糖和可溶性蛋白含量降低至0.135%和0.073 6 mg/g，大部分营养成分被转化为小分子风味物质，其主体风味物质为含硫化合物，与乳酸等酸性成分构成东北酸菜独有的品质；亚硝酸盐含量3.21 mg/kg，远低于国家标准限量要求。乳酸菌菌群对传统东北酸菜发酵过程中产品品质形成和安全性保障具有决定性作用。

东北酸菜；自然发酵；乳酸菌；营养物；同步分析

传统东北酸菜以秋后大白菜为原料，经过晾晒、烫漂(或生渍)、装缸、加水，自然低温发酵一个多月后形成酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口、增进食欲的地方特色传统发酵食品[1-3]。乳酸菌在传统发酵食品中的地位和作用越来越受关注，有关传统东北发酵酸菜中乳酸菌分离、筛选与鉴定等已有相关报道[4]，而对发酵过程中乳酸菌对产品品质形成和亚硝酸盐的降解同步研究相对很少。

传统东北酸菜发酵过程中的乳酸菌来源于发酵原料和自然环境，可利用原料中的小分子糖类物质转化为酸类代谢产物，赋予酸菜柔和的酸味；部分糖类物质被转化为醇类代谢产物，酸性代谢产物与醇类代谢物质反应后形成酯类物质，赋予产品以醇香和酯香的风味特征[5]。乳酸菌通过蛋白水解系统分解发酵基质中的可溶性蛋白形成短肽和氨基酸等小分子代谢产物，赋予产品独特的鲜味特征[6]。此外，发酵初期一些杂菌可将原料中的硝酸盐还原成亚硝酸盐并在基质中蓄积，食入过量会对人体健康造成严重危害。乳酸菌具有合成亚硝酸盐还原酶的能力，能高效、特异性降解酸菜中的亚硝酸盐[7-8]。朱军莉等[9]从自然发酵蔬菜制品中分离出3株具有较好降解亚硝酸盐的菌株LactobacillusplantarumH12、Lb.plantarumL7和、Lb.plantarumX1，亚硝酸盐降解率均高于89%。卢海强等[7]从传统东北酸菜中分离获得产亚硝酸还原酶菌株LeuconostocgelidumR11，在含125 mg/L NaNO2的MRS培养基中诱导48 h，亚硝酸盐还原酶活力为68.4 U/mL。

本研究通过对传统东北酸菜发酵过程中乳酸菌演变与营养物质和亚硝酸盐变化进行同步分析，探究乳酸菌菌群对酸菜发酵中风味物质形成和亚硝酸盐降解的地位和作用，为挖掘传统发酵食品工艺中乳酸菌的作用机制奠定理论基础，对传统发酵食品工艺现代化应用提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

大白菜：锦州市白楼农贸市场，选取成熟、无虫害、无腐烂且新鲜的大白菜。

1.2 培养基与试剂

PCA、MRS培养基，北京奥博星生物技术有限公司；考马斯亮蓝G-250，天津市福晨化学试剂厂；牛血清蛋白，北京索莱宝生物科技有限公司；醋酸铅、硫酸钠、磷酸、硫酸铜、酒石酸钾钠等(均为分析纯)，天津市风船化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

SPX-250生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；DL-CJ-2N型超级洁净工作台，东联哈尔(北京)仪器制造有限公司；GI54DS高压灭菌锅，至微仪器有限公司；THZ-D台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；PHSJ-3F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；5424R冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司； UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；7890A气质联用仪：安捷伦科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 工艺操作要点

(1)原料处理：将叶绿心黄成熟的中国大白菜在通风阳光充足下晾晒杀菌7 d，使其水分部分蒸发，将晾晒好的大白菜去根和外层菜叶，洗净晾干。

(2)热烫：将处理好的白菜浸入沸水中热烫1～2 min，放在通风处晾干。

(3)腌渍：按每100 kg大白菜在缸底添加200 g食盐，然后将白菜层层码入陶缸至缸口，在上面压上条石，用60～70 ℃温水充满缸，用塑料布封口。

(4)发酵：在5～15 ℃条件下自然发酵。

1.4.2 取样

发酵起始时间2015年11月21取样为0 d后每隔5 d取次样，分别为发酵第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d，从液面下10 cm处5点取样，共取汁液100 mL于灭菌三角瓶中，4 ℃下备用。

1.4.3 乳酸菌数测定

乳酸菌计数采用平板稀释法[10]，准确量取上述酸菜发酵液10.0 mL加入到90 mL无菌生理盐水中，振荡5 min，室温下静止10 min。吸取1.0 mL加入到9.0 mL无菌生理盐水中，依次稀释相适应的浓度，吸取1.0 mL不同梯度的稀释液，分别加入到灭菌平板中，后倾注冷却至40～45 ℃ MRS琼脂培养基25.0 mL左右，37 ℃培养48 h。

1.4.4 发酵液中营养物分析

1.4.4.1 pH测定

用pH计测定1.4.2酸菜发酵液样品的pH。

1.4.4.2 还原糖含量测定

参照文献[13]中的方法并稍作修改进行还原糖的测定。取10.0 mL发酵汁液于50 mL离心管中，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，分别取6.0 mL上清液和4.0 mL菲林试剂于试管中，摇匀加塞后在沸水浴中加热15 min，取出后立即用自来水冷却至室温后，4 ℃下4 000 r/min离心10 min。取上清液在590 nm处测定吸光值。

1.4.4.3 可溶性蛋白含量测定

参照文献[13]中的考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白。吸取2.0 mL发酵汁液于离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取1.0 mL上清液以蒸馏水为空白对照组，放入带塞试管中，加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2 min后，在595 nm处测定吸光值。

1.4.5 HP-SPME-GC-MS分析酸菜中挥发性成分

顶空固相微萃取(HP-SPME)取样：将SPME的萃取纤维头放在气相色谱的进样口老化，老化温度300 ℃，老化时间1 h。取2 mL发酵40 d基液于15 mL顶空进样瓶中，插入75 μm PDMS萃取纤维头，加入微型磁力搅拌子，于室温50 ℃下恒温平衡40 min。拔出萃取头后迅速插入气相色谱仪进样口，250 ℃解析10 min，抽回纤维头后拔出萃取头，启动仪器采集数据。

气相色谱(GC)条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性毛细管柱；进样口温度270 ℃；载气为He；不分流模式进样；起始温度40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升温至250 ℃，保持8 min，在以20 ℃/min升至270 ℃保持1 min。

质谱(MS)条件：色谱-质谱接口温度280 ℃，离子源温度 230 ℃；四级杆温度为 150 ℃；离子化方式：EI；电子能70 eV；质量扫描范围m/z30～50。

定性和定量分析：样品中挥发性成分定性分析首先经气相色谱分离，用质谱进行鉴定。分析结果利用计算机谱库(Nist/Wiley)进行初步检索及资料分析，结合相关文献，确定挥发性物质的化学组成。通过各挥发性化合物的峰面积进行定量分析。

1.4.6 安全指标测定

1.4.6.1 细菌菌落总数测定

按国家标准GB 4789.2—2010的方法进行测定[11]。

1.4.6.2 亚硝酸盐测定

按GB 2005.33—2010中分光光度法进行测定[12]。

1.4.7 数据处理

所有实验均重复测定3次，数据采用(平均值±标准差)表示。采用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计和显著性分析，采用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌与pH、还原糖和可溶性蛋白的同步分析

2.1.1 pH值

pH是影响传统东北酸菜产品品质的重要因素之一。图1是传统东北酸菜发酵过程中乳酸菌和基质pH的变化情况，从中可看出，发酵0～10 d之间，发酵液的pH快速下降(P<0.05)，从pH 6.69下降到pH 4.33，乳酸菌在这一阶段处于持续上升趋势，可能是乳酸菌在厌氧条件下分解糖类产生乳酸等酸性物质[16]。发酵从10～25 d期间，pH维持在pH 4.33～4.18之间，pH变化不显著；发酵从30～40 d，pH进一步下降并稳定在pH 3.74～3.64之间。pH降低不仅能够影响一些不耐酸的微生物生长繁殖，同时也赋予了酸菜柔和的酸味[5]。杜书等[6]研究发现，pH值在整个发酵过程中持续下降，最终发酵成熟时pH维持在3左右，与本研究结果相似。

图1 传统东北酸菜发酵过程中基质pH变化Fig.1 Changes of pH during fermentation of traditional Northeastern Suancai in China

2.1.2 还原糖含量

乳酸菌可利用还原糖生成醇、酸和酯等风味物质。如图2所示，还原糖含量在整个发酵过程中呈下降的趋势。发酵从0～15 d，还原糖含量较高，为乳酸菌提供了丰富的营养物，使其大量繁殖；随着乳酸菌数量增加，在发酵15～20 d，还原糖含量由1.93%下降到0.10%，呈显著水平(P<0.05)；发酵20～35 d期间，还原糖含量维持在0.10%左右，35 d时还原糖含量出现上升，原因是发酵原料中的糖类溢出。第40天时，还原糖含量进一步下降至0.007%，原因是乳酸菌上升后进一步分解糖类产生醇、酸和CO2等风味物质[17]。结果表明，乳酸菌降解还原糖主要发生在0 d到20 d左右。

图2 传统东北酸菜发酵过程中还原糖含量的动态变化Fig.2 Changes in water sugar content during fermentation of traditional northeastern Suancai in China

2.1.3 可溶性蛋白含量

乳酸菌可利用原料中的可溶性蛋白，产生氨基酸和多肽等小分子物质。图3是传统东北酸菜发酵过程中乳酸菌和可溶性蛋白动态变化曲线，从中可看出，可溶性蛋白含量呈先下降后上升再下降的趋势。发酵从0～10 d时，可溶性蛋白含量下降速度最快，达到显著性水平(P<0.05)，可溶性蛋白含量由0.132 8 mg/g下降到0.070 7 mg/g，乳酸菌在这期间处于持续上升趋势[16]。发酵10～35 d期间，可溶性蛋白含量呈上升的趋势，由0.070 7 mg/g上升至0.073 6 mg/g(P>0.05)。发酵40 d时，发酵液中可溶性蛋白含量降低至0.053 3 mg/g。DO等[18]研究表明，Lactobacillusdelbrueckii具有能够编码氨肽酶、氨基酸支链酶和蛋白质水解酶等基因，从而合成相应的酶降解蛋白质和支链氨基酸产生游离氨基酸等。结果表明，乳酸菌对可溶性蛋白的利用主要发生在0～10 d左右。

图3 传统东北酸菜发酵过程中可溶性蛋白含量的动态变化Fig.3 Changes in water soluble protein content during fermentation of traditional northeastern Suancai in China

2.2 挥发性风味成分分析

采用GC-MS联用，共检测到发酵液中30种挥发性化合物，表1列出了挥发性物质数量及含量占总挥发性物质的比例。从中可看出，共鉴定出醇类5种，胺类、酸类、酯类、烷类和烯类各2种，含硫化合物6种，酚类3种，腈类1种；除此之外，还含有少喹啉、吲哚和含苯环的其他物质。二甲基三硫和1-异硫代氰酸丁酯相对含量较高为29.16%和11.53%，其次是5-己腈、棕榈酸、二甲基二硫和3-丁烯基异硫氰酸酯。其中，二甲基二硫具有刺激性的洋葱味，二甲基三硫具有肉样和洋葱蔬菜样香气，均来源于大白菜中的蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸的降解产物，如甲硫醇氧化后形成含硫化合物，气味阈值较低，对酸菜的风味贡献较大[19]。1-异硫代氰酸丁酯和3-丁烯基异硫氰酸酯具有强烈辛辣味和芳香味，大白菜组织细胞破裂后细胞中芥子苷在芥子酶催化作用下水解，在pH 5.0～8.0时产生异硫氰酸酯类，在pH 2.0～4.0时形成5-己腈和苯代丙腈等腈类化合物[20]。酸菜中酸类物质来源于发酵过程中乳酸菌代谢中的氨基酸脱氨反应，如棕榈酸和肉豆蔻酸等。结果表明，酸菜发酵成熟后风味物质以含硫化合物、烯类、酸类和醇类为主，相对含量分别为60.08%、11.43%、10.70%和4.98%。其中二甲基三硫和异硫氰酸酯类对产品的风味贡献较大。杜书等[21]研究发现自然发酵酸菜中的主体风味成分为二甲基二硫、二甲基三硫和(E,Z)-2,6-壬二烯醛，与本研究主体风味成分相似。

表1 传统东北酸菜主要挥发性风味物质及其相对含量

2.3 乳酸菌与细菌菌落总数和亚硝酸盐变化

在传统东北酸菜发酵初期，乳酸菌和杂菌共存于发酵基质中，随着发酵进行发酵基质形成了微好氧环境，促进乳酸菌的生长繁殖，而使一些需氧性杂菌生长受到抑制[14]。图4是传统东北酸菜腌渍过程中乳酸菌、细菌菌落总数和亚硝酸盐含量的同步变化。从中可看出，乳酸菌数量呈现先扬后抑再上升并趋于平稳的发展过程，细菌菌落总数则是先上升然后逐步下降的走向。发酵初期原料中乳酸菌为2.15 lg CFU /mL低于细菌菌落总数1个数量级。发酵从0 d到10 d期间，乳酸菌和细菌菌落总数呈同步上升，第10 d达到峰值，此时细菌菌落总数高出乳酸菌3个数量级。第20 d细菌菌落总数仍高于乳酸菌占主导地位。发酵后期35 d到40 d乳酸菌上升至6.64 lg CFU/mL，细菌菌落总数下已降至5.54 lg CFU/mL，乳酸菌明显高于细菌菌落总数成为优势菌群。

发酵原料中含有假单胞菌属、肠杆菌科和葡萄球菌属等杂菌形成硝酸盐还原酶可将植物体内的硝酸盐转变为亚硝酸盐[22]。而乳酸菌产生的亚硝酸盐还原酶可降解发酵酸菜中的亚硝酸盐，其机理分为2个阶段，发酵初期，发酵液pH高于4.5以酶降解为主；发酵后期，pH低于4.0以酸降解为主[8]。如图4所示，亚硝酸盐含量呈先上升后下降最后达到稳定的趋势。发酵从0～15 d期间，亚硝酸盐含量呈上升的趋势，发酵第15天时达到最大值为24.17 mg/kg超过国家限定标准。发酵20～30 d亚硝酸盐含量快速下降，达到显著水平(P<0.05)，发酵30 d亚硝酸盐含量下降到4.13 mg/kg。发酵30～40 d，亚硝酸盐的含量继续下降，最终维持在3.0 mg/kg左右，远低于20 mg/kg的国家限量标准[15]。

3 结论

传统东北酸菜自然发酵过程中乳酸菌为优势微生物类群，能有效提高产品的风味品质并延长贮藏期。本研究通过传统东北酸菜自然发酵过程中乳酸菌与营养物质的同步分析，表明乳酸菌可利用发酵基质中还原糖、可溶性蛋白等形成各类风味成分，其主体风味物质为含硫化合物。乳酸菌可降低基质中pH，有效抑制其他微生物生长，并对酸菜中亚硝酸盐具有降解作用。发酵30 d后酸菜进入可食用期，35 d后为最佳食用期。本研究结果表明乳酸菌在传统东北酸菜自然发酵过程中对产品风味及特有品质形成起到决定性作用，并能够降解亚硝酸盐和抑制杂菌生长，使产品安全性得到保障。本研究为传统东北酸菜现代化生产提供理论和应用参考。

[1] 李宝树, 杨文铎.关于东北酸菜(酸渍大白菜之一)若干问题的探讨[J].吉林蔬菜,2012(7):45-48.

[2] CHO S K, EOM H J, MOON J S, et al. An improved process of isomaltooligosaccharide production in kimchi involving the addition of aLeuconostocstarter and sugars[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 170(3):61-64.

[3] 宋春璐, 胡文忠, 陈晨,等. 酸菜发酵工艺与贮藏特性的研究进展[J]. 食品工业科技, 2016,37(9),376-379.

[4] 侯保朝, 陈丽娥, 陈苏,等. 功能性乳酸菌的筛选、鉴定及抗氧化性能的初步评价[J]. 食品工业科技, 2015, 36(24): 145-150.

[5] ABDEL-RAHMAN M A, TASHIEO Y, SONOMOTO K. Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: overview and limits[J]. Journal of biotechnology, 2011, 156(4): 286-301.

[6] 杜书, 岳喜庆, 武俊瑞,等.自然发酵酸菜游离氨基酸的分析[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(2):174-176.

[7] 卢海强, 霍文敏, 谷新晰,等. 产亚硝酸盐还原酶低温乳酸菌的筛选鉴定及发酵特性[J]. 河北农业大学学报, 2015,37(1):87-91.

[8] OHC K, OH M C, KIM S H. The depletion of sodium nitrite by lactic acid bacteria isolated from kimchi[J]. Journal of Medicinal Food, 2004, 7(1):38-44.

[9] 朱军莉, 赵进, 朱雅霏. 自然发酵蔬菜制品中降解亚硝酸盐乳酸菌的分离与鉴定[J]. 中国酿造, 2015, 34(6): 39-42.

[10] OUATTARA D H, OUATTATA H G, GOUALIE B G, et al. Biochemical and functional properties of lactic acid bacteria isolated from Ivorian cocoa fermenting beans[J]. Journal of Applied Biosciences, 2014, 77:6 489-6 499.

[11] GB 4789.2—2010. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2010.

[12] GB 2005.33—2010. 食品中亚硝酸盐与硝酸的测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2010.

[13] 曹健康, 姜微波, 赵玉梅，等. 果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：中国轻工业出版社,2007:66-68.

[14] 林颖, 王旭太, 刘仁奉. 酸菜在腌渍过程中的变化及毒理学研究(综述)[J]. 中国食品卫生杂志, 2000, 12(5):38-39.

[15] GB 2714—2015. 食品安全国家标准 酱腌菜[S].北京:中国标准出版社, 2015.

[16] WU R N, WU Z X, ZHAO C Y, et al. Identification of lactic acid bacteria in suancai, a traditional Northeastern Chinese fermented food, and salt response ofLactobacillusparacasei, LN-1[J]. Annals of Microbiology, 2013, 64(3):1 325-1 332.

[17] 杨洪岩, 李超, 刘通,等. 传统东北酸菜发酵过程中的细菌动态及多样性[J]. 食品工业科技, 2015, 36(1):154-159.

[18] DO C A, DA S D, DE O M, et al. Genes involved in protein metabolism of the probiotic lactic acid bacteriumLactobacillusdelbrueckiiUFV H2b20[J]. Beneficial Microbes, 2011, 2(3): 209-220.

[19] CHIN H W, LINDSAY R C. Mechanisms of formation of volatile sulfur compounds following the action of cysteine sulfoxide lyases[J]. Masui the Japanese Journal of Anesthesiology, 2012, 58 (7): 281-286.

[20] CHIN H W, LINDAY R C. Volatile sulfur compounds formed in disrupted tissues of different Cabbage Cultivars[J]. Journal of Food Science, 2006, 58(4):835-839.

[21] 杜书. 酸菜自然发酵过程中风味及质地变化规律研究[D]. 沈阳:沈阳农业大学, 2013:40-45.

[22] 燕平梅, 薛文通, 张慧,等. 不同贮藏蔬菜中亚硝酸盐变化的研究[J]. 食品科学, 2006, 27(6):242-246.

Synchronization analysis of lactic acid bacteria and nutrients during fermentation of traditional Northeastern Suancai in China

MA Huan-huan1, LV Xin-ran2, LIN-yang1, SUN Meng-tong1,BAI Feng-ling1*, LI Jian-rong1

1(College of Food Science and Technology, Bohai University; Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Jinzhou 121013, China)2(College of Biology Science and Technology, Beijing Forest University, Beijing 100083, China)

Lactic acid bacteria (LAB)are the major microbe flora in natural fermentation fluid of traditional Northeastern Suancai in China, which plays a key role in the formation of flavor and the degradation of nutrient substances. In this study,the changes in the counts of LAB, reducing sugars and soluble protein during the fermentation process of traditional Northeastern Suancai were synchronously analyzed. The results indicated that Suancai fermented by LAB entered into the mature period in 35 days at 5-15 ℃. The LAB became dominant microbes with counts of 6.61 lg CFU/mL, which was 1.0 log units higher than total number of bacterial colonies. The contentsof reducing sugar and soluble protein decreased to 0.135% and 0.073 6 mg/g, respectively, which indicated that most nutrient substances were transformed into small molecular flavor substances. The main flavor substances were sulfur compounds, which was combined with lactic acid and other acidic ingredients to constitute the unique quality of Suancai. Moreover, the content of nitrite in Suancai was 3.21 mg/kg, which was lower than the requirement of national standard. LAB had a decisive influence on the formation of product quality and the security measure during the fermentation process of traditional Northeastern Suancai.

Northeastern Suancai；natural fermentation；lactic acid bacteria；nutrients； synchronization analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702014

硕士研究生(白凤翎教授为通讯作者，E-mail：baifling@163.com)。

辽宁省科技厅攻关项目(2015103020)；泰山学者蓝色产业领军人才团队支撑计划项目 ( 鲁政办字(2015)19号

2016-09-23，改回日期：2016-10-19