加工方式对羊乳中类胰岛素生长因子I浓度的影响

徐连应，侯院林，王毕妮，张富新

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

加工方式对羊乳中类胰岛素生长因子I浓度的影响

徐连应，侯院林，王毕妮，张富新*

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

采用双抗体夹心酶联免疫法测定羊乳中类胰岛素生长因子I(IGF-I)的浓度，主要研究了巴氏杀菌、超高温灭菌、搅拌、均质以及发酵等加工方式对羊乳中IGF-I浓度的影响。研究结果表明，巴氏杀菌可使羊乳中IGF-I的浓度降低，但72 ℃/15 s巴氏杀菌条件对羊乳中IGF-I浓度的影响相对较小；137 ℃/2 s超高温灭菌条件对羊乳中IGF-I浓度的影响较大；均质和搅拌对羊乳中IGF-I的浓度基本无影响；发酵会使羊乳中IGF-I的浓度显著降低。因此，在开发富含IGF-I的功能性羊奶产品时，可选择72 ℃/15 s的巴氏杀菌条件，生产中均质和搅拌2种加工方式均可以采用，但不宜将其发酵成酸奶制品。

羊乳；IGF-I浓度；加工方式；双抗体夹心酶联免疫法

乳是人类营养物质的重要来源，不仅含有人体所需的各种营养成分，还含有多种生物活性物质，其中类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor, IGF)是乳中生物活性物质的重要组成成分，可以影响多种细胞的增殖与分化[1]，具有细胞增生的长期性效应[2]，对新生儿胃肠道的发育也具有重要的生理作用[3-5]。乳中IGF主要以IGF-I和IGF-II形式存在，其IGF-I浓度和生理活性远大于IGF-II[2]。IGF-I是由70个氨基酸组成的分子质量为7.6 kDa的单链多肽，有3个二硫键。IGF-I对糖尿病具有一定的辅助疗效[6-8]，现代医学显示，IGF-I对机体血糖的下调作用相当显著[9]。中国古代著名医书《本草纲目》中也记载羊奶具有治疗糖尿病的作用。目前，虽然有关IGF-I对哺乳动物的生理功能方面的研究报道较多[10-11]，但有关乳品加工过程中，IGF-I变化的报道较少。由于IGF-I易受pH、温度等环境因素的影响而发生氧化、变性、聚集或沉淀反应等不良反应；另外，乳品加工过程中常伴随有均质、杀菌、喷雾干燥等不同工艺[12-13]，这些加工方式也会造成乳制品中的IGF-I浓度降低，严重削弱乳制品的营养价值[14-15]。因此，本文主要研究和评估加工方式对羊乳中IGF-I浓度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊乳乳样采集自西北农林科技大学试验农场，奶山羊采食相同饲料及饮料，饲养条件一致。采集健康、饲养条件相同的奶山羊，人工挤奶方式采样，采样前用干净毛巾对乳房清洗，并弃去前3把奶(约30 mL)，然后用预先灭菌的取样管采集挤奶中段的乳样。每只羊收集50 mL乳样，共收集20个奶样，然后人工混匀制成混合样，立即在-40 ℃下冷冻保存。

山羊乳IGF-I双抗体夹心酶联免疫试剂盒、IGF-II标准品，美国R&D公司；保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌(LA)、副干酪乳杆菌(LP-01)，森博试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MDF-U5411型低温冰箱，日本三洋电机有限公司；ND-50型培养箱，宁波江南仪器有限公司；HDM-3000型数字控温电热套，江苏荣华仪器有限公司；TGL-16B型台式低温高速离心机，海安亭科学仪器厂；GSP-9080MBE型隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Multiskan Go型全波长酶标仪，美国热电公司；JJ-006/60均质机，廊坊通用机械有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；XMTD型数显恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司；KQ3200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；移液器(量程：0.5～10、10～100、100～1 000 μL)，德国Eppendorf公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 测定方法

1.3.1 样品处理

样品处理按CASTIGLIEGO[16]方法并加以改进。将冷冻的乳样在室温下缓慢解冻后，用移液器吸取1 mL乳样置于2 mL离心管中，在3 000 g下离心15 min脱脂，吸取400 μL的脱脂乳，加入40 μL 2 mol/L的HCl，充分混合，室温下静置30 min后，在4 ℃，10 000 g下离心30 min。吸取100 μL的上清液，添加264 μL的缓冲溶液(由11.7 mmol/L KH2PO4; 36.2 mmol/L Na2HPO4; 60 mmol/L Tris-base; 体积分数0.07 %, Tween 20; 250 ng/mL IGF-II组成)，充分混合后，再在4 ℃，10 000 g下离心10 min，取上清液，用于试剂盒检测IGF-I浓度。

1.3.2 IGF-I的检测

IGF-I浓度采用双抗体夹心酶联免疫(ELISA)试剂盒测定。将试剂盒在室温25 ℃下平衡20 min后，取出试剂盒中板条。取10 μL处理后的乳样加入板条反应孔中，然后加入样品稀释液40 μL，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体液50 μL，用封板膜封住反应孔后，在37 ℃下保温60 min。保温结束后弃去反应孔中液体，将板条翻转，在滤纸上拍干。在反应后的反应孔中加入350 μL洗涤液，静置1 min后，弃去洗涤液，在滤纸上拍干，如此重复5次。在洗涤后的板条反应孔中加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光保温15 min。最后在反应孔中加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔吸光度。每个样品重复3次。

1.3.3 IGF-I浓度的计算

将山羊IGF-I酶联免疫试剂盒中浓度为10 ng/mL的IGF-I标准品用试剂盒中的标准品稀释液依次稀释成浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL的溶液。用1.3.2方法检测不同浓度IGF-I标准品的吸光度，然后以IGF-I标准品的浓度为横坐标(x)，OD值为纵坐标(y)，绘制IGF-I标准曲线，计算线性回归方程(Y=0.137 1X+0.017 2，R2=0.991 8)，按回归方程计算测试样品中IGF-I浓度。

1.4 实验方法

1.4.1 巴氏杀菌对羊乳中IGF-I浓度的影响

将乳样分别在65 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/10 s巴氏杀菌后，测定其IGF-I的浓度。

1.4.2 超高温灭菌对羊乳中IGF-I浓度的影响

将乳样分别在121 ℃/4 s、137 ℃/2 s超高温灭菌后，测定其IGF-I的浓度。

1.4.3 均质对羊乳中IGF-I浓度的影响

在室温条件下，取300 mL乳样，分别在10、20、30、40 MPa的压力下均质后，测定其IGF-I的浓度。

1.4.4 搅拌对羊乳中IGF-I浓度的影响

取50 mL乳样，在室温条件下，分别在800 r/min和3 500 r/min转速下搅拌15 min，测定其IGF-I的浓度。

1.4.5 发酵对羊乳中IGF-I浓度的影响

取乳样杀菌，冷却到45 ℃后，分别接种保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌(LA)、副干酪乳杆菌(LP-01)，按照酸奶的生产工艺分别进行发酵和后发酵，测定其IGF-I的浓度。

1.5 数据处理

试验数据均采用DPS统计分析软件进行处理，采用Duncan新复极差法对数据进行显著性检验分析。

2 结果与分析

2.1 巴氏杀菌对羊乳中IGF-I浓度的影响

将乳样分别在65 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/10 s巴氏杀菌后，测定其IGF-I的浓度，结果如图1所示。

图1 巴氏杀菌对羊乳IGF-I浓度的影响Fig.1 Effects of pasteurization on the concentration of IGF-I in goat milk注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

由图1可以看出，巴氏杀菌可使羊乳中IGF-I的浓度降低(P<0.05)，但不同的杀菌条件对羊乳中IGF-I浓度的影响不同。在72 ℃/15 s巴氏杀菌条件下，羊乳中IGF-I浓度为(28.85±1.14) ng/mL，显著高于65 ℃/30 min和85 ℃/10 s巴氏杀菌条件下的IGF-I浓度(P<0.05)。表明72 ℃/15 s巴氏杀菌条件能最大限度保护羊乳中IGF-I的浓度。巴氏杀菌强度取决于杀菌温度和杀菌时间两个方面[17]，在65 ℃/30 min杀菌条件下，尽管杀菌温度较低，但由于杀菌时间较长，乳中IGF-I的结构会遭到破坏，使其活性降低；在85 ℃/10 s杀菌条件下，尽管杀菌时间较短，但杀菌温度较高，也会破坏IGF-I的结构，使其活性降低。

2.2 超高温灭菌对羊乳中IGF-I浓度的影响

将乳样分别在121 ℃/4 s、137 ℃/2 s超高温灭菌后，测定其IGF-I的浓度，结果如图2所示。

由图2可以看出，超高温灭菌可使羊乳中IGF-I的浓度降低(P<0.05)。采用121 ℃/4 s的超高温灭菌条件时，羊乳中IGF-I浓度为(28.35±1.56) ng/mL，比对照组下降12.4%，而采用137 ℃/2 s灭菌条件时，羊乳中IGF-I浓度为(26.64±1.56) ng/mL，比对照组下降了17.7%，但这2种杀菌条件对羊乳中IGF-I浓度影响无明显差异(P>0.05)。乳中IGF-I的浓度与其结构密切相关，IGF-I是一个分子质量为7.6 kDa的活性多肽，其结构中含有二硫键，热处理会引起多肽结构中二硫键的断裂，致使其结构遭到破坏，可能会造成IGF-I发生变异或变性等，导致羊乳中IGF-I浓度的下降[18-24]。

2.3 均质对羊乳中IGF-I浓度的影响

将羊乳分别在10、20、30、40 MPa的压力下均质3 min后，测定其IGF-I的浓度，结果如图3所示。

图3 均质压力对羊乳IGF-I浓度的影响Fig.3 Effects ofhomogenating pressure on the concentration of IGF-I in goat milk注：相同小写字母表示处理间差异不显著(P>0.05)。

由图3可以看出，均质对羊乳中IGF-I的浓度基本无影响(P>0.05)。当均质压力从10 MPa升高到40 MPa时，羊乳中IGF-I的浓度从(30.33±0.42) ng/mL变化到(30.53±1.26) ng/mL，随着均质压力的增大，IGF-I的浓度基本保持稳定，变化幅度不大(P>0.05)。尽管随着均质压力的增大，乳中会逐渐形成大小均一且形状规则的小颗粒，但由于IGF-I是一个分子质量仅为7.6 kDa的活性多肽，相较于乳中的蛋白质、脂类等其他物质，其分子质量较小[25]，属于小颗粒类物质，均质并不会对乳中IGF-I的空间结构造成影响，与云振宇等人的研究结果基本相似[26]。

2.4 搅拌对羊乳中IGF-I浓度的影响

将羊乳分别在800 r/min和3 500 r/min转速下搅拌15 min，测定其IGF-I的浓度，结果如图4所示。

图4 搅拌对羊乳IGF-I浓度的影响Fig.4 Effects of agitation onthe concentration of IGF-I in goat milk注：相同小写字母表示处理间差异不显著(P>0.05)。

由图4可以看出，搅拌对羊乳中IGF-I的浓度基本无影响(P>0.05)。当搅拌速度从低速升高到高速时，IGF-I的浓度从(30.31±1.90) ng/mL变化到(30.96±1.37) ng/mL，随着搅拌速度的增大，IGF-I的浓度基本保持稳定，变化幅度不大(P>0.05)。这表明搅拌可能并不会使IGF-I在乳中的分布发生变化，因此不会对乳中IGF-I的浓度有影响。

2.5 发酵剂对羊乳中IGF-I浓度的影响

采用接种保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌(LA)、副干酪乳杆菌(LP-01)，按照酸奶的生产工艺分别制作酸奶，测定其IGF-I的浓度，结果如图5所示。

由图5可以看出，发酵会使羊乳中IGF-I的浓度显著降低(P<0.01)，但不同种发酵剂之间IGF的浓度差异不大(P>0.05)。当在羊乳中分别添加保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌3种发酵剂，经发酵后，IGF-I的浓度从原料乳中的(32.37±1.38) ng/mL分别降低到(8.35±1.35)、(9.90±1.45)、(9.84±0.96) ng/mL，说明发酵可降低羊乳中IGF-I浓度。在羊乳发酵的过程中，羊乳中的IGF-I会被作为乳酸菌生长繁殖所需的营养物质而进行分解利用，导致乳中的IGF-I浓度急剧下降，而添加不同发酵剂的羊乳中，IGF-I的浓度有差异可能是由于不同发酵剂分解利用IGF-I作为其生长所需营养物质的能力不同而导致的[27]。

图5 发酵剂对羊乳IGF-I浓度的影响Fig.5 Effects of fermentation onthe concentration of IGF-I in goat milk注：不同小写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

3 结论

本文研究了加工方式对羊乳中IGF-I浓度的影响，结果表明，巴氏杀菌可使羊乳中IGF-I的浓度降低，但72 ℃/15 s巴氏杀菌对羊乳中IGF-I浓度的影响相对较小；137 ℃/2 s超高温灭菌对羊乳中IGF-I浓度的影响较大；均质和搅拌对羊乳中IGF-I的浓度基本无影响；发酵会使羊乳中IGF-I的浓度显著降低。因此，在开发富含IGF-I的功能性羊奶产品时，可选择72 ℃/15 s的巴氏杀菌条件，生产中均质和搅拌两种加工方式均可以采用，但不宜将其发酵成酸奶制品。

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Effects of processing modes on the concentration of insulin-like growth factor-I in goat milk

XU Lian-ying, HOU Yuan-lin, WANG Bi-ni, ZHANG Fu-xin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Effects of pasteurization, UHT, stirring, homogenizing and fermentation on the concentration of insulin-like growth factor-I (IGF-I) in goat milk were studied by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. The result showed that pasteurization caused the decrease of IGF-I concentration, but pasteurization at 72 ℃ for 15 s had a relatively mild effect on IGF-I. UHT at 137 ℃ for 2 s had a relatively strong effect on the concentration of IGF-I. Besides, homogenizing and stirring had little effect, and fermentation could significantly reduce the concentration of IGF-I. Therefore, when developing new functional foods rich with IGF-I, pasteurization at 72 ℃ for 15 s, homogenizing and stirring can be adopted, but fermentation products should be avoided.

goat milk; the concentration of insulin-like growth factor I (IGF-I); processing modes; double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702011

硕士研究生(张富新教授为通讯作者，E-mail: 757443051@qq.com)。

陕西省重大科技成果转化引导专项(2016KTCG01-12)

2016-06-08，改回日期：2016-07-22