葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚诱导的免疫毒性

万一方，叶思言，段淑琪，杜声杰，阮馨慰，许美玉

(北京林业大学生物科学与技术学院/林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083)

葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚诱导的免疫毒性

万一方，叶思言，段淑琪，杜声杰，阮馨慰，许美玉

(北京林业大学生物科学与技术学院/林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083)

3-甲基-4-硝基苯酚(PNMC)是重要的汽车尾气有效活性成分，对小鼠脾淋巴细胞具有免疫毒性作用。作为食物多酚类物质，原花青素具有抑制各种毒性作用，而葡萄籽富含原花青素。用细胞活力分析和ELISA实验，研究葡萄籽原花青素对PNMC免疫毒性影响结果表明：葡萄籽原花青素显著抑制PNMC对脾淋巴细胞增殖的毒性作用，缓解PNMC对脾T淋巴细胞分泌白细胞介素2、4及颗粒酶B功能的损伤作用。测定OH·、SOD、GSH-Px 和MDA指标的抗氧化试验结果表明：葡萄籽原花青素缓解PNMC对脾淋巴细胞的免疫毒性作用与其抗氧化作用具有密切关系。

葡萄籽原花青素；3-甲基-4-硝基苯酚；缓解免疫毒性；脾淋巴细胞

机动车尾气排放已经成为我国大中城市空气污染的重要来源之一，柴油车尾气颗粒的有效成分硝基苯酚类物质PNMC，不仅可以改变大鼠血液中生化指标，降低血液中的白细胞(淋巴细胞)的数量[1]，而且对大鼠的脾脏的重量及脾T淋巴细胞的数量都具有选择性影响[2]。脾淋巴细胞包括T细胞和B细胞，T细胞通过产生及释放白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和颗粒酶B(granzyme-B)等细胞因子来发挥其免疫作用。PNMC不仅抑制小鼠脾淋巴细胞增殖，也影响脾T淋巴细胞分泌细胞因子[3]。有研究表明，具有抗氧化作用的物质，能够降低机动车尾气造成的机体损害[4]。

我国葡萄资源较为丰富，而大多数的葡萄用于酿酒。工业酒的生产伴随着大量的垃圾，每年生产出数以万吨计酿酒葡萄废弃物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽等[5-6]。大多数葡萄籽被丢弃，利用率很低，造成了极大的资源浪费[6]。葡萄籽中富含多酚类物质，原花青素是葡萄籽中的主要多酚物质[7]。原花青素具有很强的抗氧化作用，其自由基清除能力比维生素C和维生素E高很多[8-9]。近年来，原花青素被报道具有缓解硝基苯酚PNP诱导的生殖细胞氧化损伤等各种毒性作用[10]。因此，葡萄籽原花青素可能具有缓解硝基苯酚诱导免疫毒性的作用。研究葡萄籽原花青素对汽车尾气活性成分诱导的免疫毒性影响，不仅为葡萄籽的有效科学利用提供理论依据，也对解决由空气污染引起的健康问题的防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清洁级8w龄昆明雄性小鼠(军事医学科学院实验动物中心)；PNMC(TCI，日本)；RPMI 1640培养基(北京协和医学院细胞中心)；酶标仪(BIO-RAD)；CO2培养箱(Thermo SCIENTIFIC)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽原花青素提取 葡萄籽粉碎后经石油醚脱脂并干燥，准确称取1.0 g干燥脱脂葡萄籽粉置于100 mL三角瓶中，加入20 mL pH 4.0的缓冲液，调节纤维素酶液活力至100 U/mg，45 ℃酶解1.0 h后迅速升温至90 ℃充分灭活，1 500 r/min离心分离并保存上清液，加入70%的乙醇溶液于50 ℃水浴30 min后进行抽滤、70℃减压蒸馏浓缩至没有液滴滴出、浓缩物经冷冻干燥得葡萄籽原花青素粗提物。在100 mL锥形瓶中加入5 g经前处理好的AB-8大孔树脂，再加入50 mL 3 mg/mL 原花青素粗提物水溶液，放入25 ℃摇床中振荡吸附24 h(振荡速度为160 r/min)，过滤除去未吸附的原花青素粗提物水溶液，蒸馏水冲洗过的树脂倒入50 mL 50%的乙醇中25 ℃、160 r/min解吸24 h，滤出解析液、70 ℃减压蒸馏浓缩至没有液滴滴出，冷冻干燥得到葡萄籽原花青素提取物。

1.2.2 小鼠脾淋巴细胞的制备 小鼠脱颈处死，放入75%乙醇中杀菌3min。无菌状态下取脾，置于200目筛网上，一边滴加RPMI 1640完全培养基，一边轻轻研磨，冲洗并收集筛网上脾研磨液。向脾研磨液中加入5.0mL RPMI 1640完全培养基均质，离心(1 500r/min、5min)得脾细胞沉淀，取适量NH4Cl(0.8%，w/v)裂解液裂解红细胞3min。再次离心(1 500r/min、5min)分离得细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次，再用PRMI 1640完全培养基洗涤细胞沉淀1次，离心(1 500r/min、5min)得细胞沉淀。加入RPMI 1640完全培养基重悬脾细胞。用台盼蓝对脾细胞进行染色，活细胞计数将存活率控制在95%以上。

1.2.3 细胞活力测定 制备浓度为5×106cells/mL脾淋巴细胞悬液，向96孔板中加入脾淋巴细胞单细胞悬液100μL/well，37℃、5% CO2的培养箱中培养4h。按实验设计每孔加入100μL样品，对照组为RPMI 1640完全培养基、染毒组为10-4mol/L PNMC、保护组为10-4mol/L PNMC。将加完样的96孔细胞培养板置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48h。向96孔细胞培养板中加入20μL/well的MTT溶液，继续置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养4h。小心吸弃150μL上清液，每孔加入150μL DMSO，摇床20min。将96孔细胞培养板于570nm波长下用酶标仪测定各孔吸光值(OD)并记录。

1.2.4 细胞因子的测定 向96孔板中加入脾淋巴细胞单细胞悬液100μL/well，37℃、5% CO2的培养箱中培养4h。然后按实验设计每孔加入100μL样品，其中对照组为RPMI 1640完全培养基、染毒组10-4mol/L PNMC、保护组为10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL 原花青素，再置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48h。收集上清液待测。按照酶联免疫试剂盒说明书的方法测定上清液中各个细胞因子的含量。

1.2.5 OH·、MDA、SOD及GSH-Px水平的测定 脾淋巴细胞单细胞悬液以100μL/well的添加量加入96孔细胞培养板中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养4h。然后按实验设计每孔加入100μL样品，其中对照组为RPMI 1640完全培养基、染毒组为10-4mol/L PNMC、保护组为10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL PC，再置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48h按照抗氧化实验方法测定。OH·水平通过酶标仪550nm各孔吸光值(OD)确定、MDA水平通过酶标仪532nm各孔吸光值(OD)确定、SOD水平通过酶标仪450nm各孔吸光值(OD)确定、GSH-Px活性的测定包括酶促反应和显色反应，最后酶标仪412nm测定各管吸光度值(OD)。

1.2.6 统计学分析 所有试验均进行3组重复试验，所有数据均以平均值±标准偏差来表示，方差分析使用SPSS软件进行a post hoc test及Tukey’s test，P<0.05为统计学上显著性差异、P<0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚对脾淋巴细胞的增殖毒性

为研究葡萄籽原花青素对PNMC诱导脾淋巴细胞增殖毒性的影响，将脾淋巴细胞分为对照组(control)、染毒剂组(PNMC)和保护组(PNMC+PC)等3个组，培养48h后通过MTT法检测细胞活力。对照组为用正常培养基处理的细胞，染毒剂组为用10-4mol/L PNMC处理的细胞，保护组为10-4mol/L PNMC和 1.0μg/mL原花青素(PC)处理的细胞。细胞活力实验结果显示，单独用PNMC处理的染毒剂组脾淋巴细胞活力明显下降至87.60%(与对照组相比，P<0.05)，而当PNMC与PC共同处理脾淋巴细胞时，细胞活力为95.38%(与PNMC组相比，P<0.05；与对照组相比，无显著性差异)，细胞活力下降得到显著抑制，基本恢复到对照组的水平(图1)。以上结果表明，葡萄籽原花青素能够显著抑制PNMC对小鼠脾淋巴细胞产生的增殖毒性作用。

图1 葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚 对脾淋巴细胞的增殖毒性 注：脾淋巴细胞与培养基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+ PC(1.0μg/mL)共培养48h，PC代表原花青素；与对照相比，*P<0.05为显著性差异；与PNMC相比，#P<0.05为显著性差异

2.2 葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚干扰脾T淋巴细胞分泌细胞因子功能作用

脾脏是人体最大的免疫器官，可以调节造血功能和免疫系统，是机体抵御外界入侵的天然防线。脾脏中含有大量的淋巴细胞，其中脾T淋巴细胞可分泌多种细胞因子来调节免疫功能，IL-2、IL-4和granzyme-B是由脾T淋巴细胞分泌的3种重要的具有免疫调节功能的细胞因子。为研究葡萄籽原花青素是否具有缓解PNMC干扰脾T淋巴细胞分泌细胞因子功能作用，通过ELISA实验测定细胞因子浓度来进行评估。ELISA实验结果表明，当PNMC处理小鼠脾淋巴细胞时，显著地降低了小鼠脾细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平。对照组脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4和granzyme-B分别为460、32.0、432.23 pg/mL，而PNMC处理过的染毒剂组的脾细胞分泌量分别降至163、23.78、223.73 pg/ mL。 当用原花青素同时处理暴露于PNMC的脾淋巴细胞时，其分泌细胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平，又上调至364、29.61、400.96 pg/mL(图2C)，即细胞因子分泌量下降得到抑制。以上结果表明，葡萄籽原花青素具有显著抑制PNMC干扰脾淋巴细胞分泌细胞因子功能作用。

图2 葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚对脾T淋巴细胞分泌细胞因子功能损伤 注：小鼠脾淋巴细胞和培养基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培养48h，细胞分泌IL-2(A)、IL-4(B)、granzyme-B(C)的水平；与对照相比,*P<0.05为显著性差异、**P<0.01为极显著性差异；与PNMC相比，#P<0.05为显著性差异

2.3 葡萄籽原花青素缓解硝基苯酚对脾淋巴细胞的氧化毒性

为了检测葡萄籽原花青素是否可以抑制由PNMC在脾淋巴细胞引起的氧化应激作用，本研究通过检测OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平来评估其抗氧化活性。抗氧化试验结果显示，脾淋巴细胞暴露于PNMC后，OH·和MDA含量得到显著上升，OH·含量从660.9U/mL增加至853.3U/mL(图3A)、MDA水平从0.53mmol/mL上升至0.60 mmol/mL(P<0.05)(图3D)。相反地，和对照组相比，PNMC降低了脾淋巴细胞内SOD和GSH-Px的活性，均具有显著性。SOD活性分别降低至对照的84.3%(P<0.05)(图3B)，GSH-Px的活性降低至对照的70.7%(P<0.05)(图3C)。然而，当葡萄籽原花青素联合PNMC共培养脾淋巴细胞后，OH·和MDA含量上升和SOD和GSH-Px活性降低得到显著抑制。 OH·含量仅为819.9U/mL(单独接触PNMC组为853.3U/mL，下降具有显著性，P<0.05，图3A)，MDA水平由单独接触PNMC组的0.6 mmol/mL下调至0.5 mmol/mL(下降具有显著性，P<0.05，图3D)。相反地，与单独的PNMC处理组相比，显示联合原花青素共培养后脾淋巴细胞内抗氧化酶 SOD活性84.3%恢复至89.9%(P<0.01，图3B)、GSH-Px活性从70.7%恢复至104.6%(P<0.05，图3C)。以上结果表明，葡萄籽原花青素显著缓解硝基苯酚对脾淋巴细胞的氧化毒性作用。

图3 葡萄籽原花青素对暴露于PNMC的脾淋巴细胞内OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平的影响 注：小鼠脾淋巴细胞和培养基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培养48h，细胞内OH·(A)、SOD(B)、GSH-Px(C)、MDA(D)的水平；与对照相比,*P<0.05为显著性差异；与PNMC相比,#P <0.05为显著性差异

3 结论

本文研究葡萄籽原花青素对汽车尾气有效活性成分PNMC诱导小鼠脾淋巴细胞产生免疫毒性影响的结果表明，葡萄籽原花青素不仅显著缓解PNMC对小鼠脾淋巴细胞产生的增殖毒性，还可以缓解PNMC对脾T淋巴细胞分泌细胞因子功能的损伤，起到保护脾淋巴细胞的作用。葡萄籽原花青素对PNMC诱导的免疫毒性的抑制作用与其抗氧化性具有密切的关系。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Grape Seed Proanthocyanidin Attenuates Immunotoxicity Induced by Nitrophenol

WAN Yi-fang，YE Si-yan，DUAN Shu-qi，DU Sheng-jie，RUAN Xin-wei，XU Mei-yu

(College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing 100083，China)

3-methyl-4-nitrophenol (PNMC)，as a kind of important component of vehicle emissions，has been shown to confer toxicity in splenocytes.Proanthocyanidin，as a dietary polyphenols, has been shown to confer inhibitory activity against a variety of toxins，and grape seed is rich in proanthocyanidins.The effects of grape seed proanthocyanidin on immunotoxicity induced by PNMC in murine splenic lymphocytes were investigated by Cell Viability Assay and ELISA，and the results showed that grape seed proanthocyanidin significantly enhanced proliferation of splenocytes exposed to PNMC，as well as the production of T cell-related cytokines and granzymes includinginterleukin-2，interleukin-4，andgranzyme-Bin the cells exposed to PNMC.These effects were associated with a decrease in oxidative stress，as evidenced by changes in OH·，SOD，GSH-Px，and MDA levels.

grape seed proanthocyanidin；3-methyl-4-nitropheno(PNMC)；attenuates immunotoxicity；splenic lymphocyte

北京林业大学“北京市大学生科学研究与创业行动计划”(项目编号：S201510022036)；北京市自然科学基金(项目编号：8142029)。

万一方(1996— )，女，本科生，研究方向：食品科学与工程。

许美玉(1965— )，女，副教授，研究方向：食品免疫与功能性食品。