黄皮精油对莲雾果实软腐病抑制机理的初探

张史青，钟曼茜，曾 凤，从心黎

(海南大学园艺园林学院，海口 570228)

黄皮精油对莲雾果实软腐病抑制机理的初探

张史青，钟曼茜，曾 凤，从心黎

(海南大学园艺园林学院，海口 570228)

以‘黑金刚’莲雾为试验对象，对莲雾果实采后软腐病病原菌进行了分离纯化，通过从黄皮叶子中提取的精油对软腐病进行抑菌活性测定，研究黄皮精油对菌丝体形态和结构的影响，探讨黄皮精油的抑菌机制。结果表明：不同浓度的黄皮精油对供试的莲雾软腐病均有抑制作用，其中0.6 μL/mL浓度下的抑菌率达到60.62%；0.6 μL/mL的黄皮精油处理后的菌丝体生长稀疏，分支变少；黄皮精油对病原菌的细胞膜通透性产生了显著影响，可溶性蛋白和还原性糖含量减少，营养物质吸收受阻。综合来看，初步明确了黄皮精油的抗菌机制，其中0.6 μL/mL浓度下的抑菌效果最佳。

莲雾；软腐病；黄皮；精油；抑菌效果

莲雾是一种热带常绿果树，我国广东和海南等地大面积栽培[1]。莲雾果皮薄，呼吸强度高，极其不耐贮藏且较易发生病害。引起莲雾果实采后腐烂的大多数为真菌病害，主要有炭疽病、软腐病等，目前国内对软腐病的研究工作仅限于对其形态学和常规的生理生化的研究，主要采取的防治措施包括培育抗病品种、使用化学药剂等[2-3]。随着生活水平的提高，人们对食品安全的要求也越来越高，应用绿色环保的生物保鲜剂会更加有利于鲜果产业的发展。吴新[3-4]研究表明，香芹酚、肉桂醛、紫苏醛、沉香萜醇和异硫氰酸烯丙酯(AITC)等5种植物精油对常见的病原真菌、细菌等都有较为广泛的抑菌作用。Smith-Palmer发现不同种植物精油混合使用或单一精油与其他抑菌物质混合使用能发挥更显著的抑菌效果。黄皮是海南普遍存在的植物材料，而以黄皮叶子提取的植物精油对莲雾果实软腐病抑制效果的研究未曾见到报道。因此，本试验对莲雾果皮上的软腐病进行分离鉴定，并用黄皮精油对其病原菌进行抑菌测定，为莲雾软腐病的抑菌机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄皮叶子，采摘自海南黄皮种植基地，晒干、粉碎；‘黑金刚’品种莲雾果实，九成熟、有病害、大小均匀，购自市场。

1.2 试验方法

1.2.1 精油的提取 采用水蒸气蒸馏法提取精油：称取200 g干燥、粉碎的黄皮叶子粉末装入2 000 mL蒸馏瓶中并加入蒸馏水1 400 mL，在蒸馏装置中进行蒸馏操作，蒸馏时间为4～6 h，至没有油状物滴出时停止蒸馏，静置片刻，收集干燥后于4℃冰箱中黑暗条件下密封保存备用[5]。

1.2.2 黄皮精油抑菌活性的测定 以菌丝生长速率法测定黄皮精油对莲雾软腐病的抑制效果。用高温灭菌的培养基制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL/mL的带精油培养基，对照加无菌水，倒大约 15 mL 带精油培养基于直径 90 mm的无菌培养皿内，每处理重复 3 皿，冷却后，接入已分离纯化并生长 3d的莲雾软腐病菌落，用直径为 5 mm 的打孔器沿菌落的边缘取菌饼接种于含有不同精油浓度梯度的培养皿中，每皿接1个菌饼，置于25 ℃恒温培养箱培养，于3 d 后用十字交叉法测量菌落的直径[4-5]，并计算其平均直径，按式(1)计算黄皮精油的抑菌率。

1.2.3 病原菌致病力测定 釆用针刺法运用柯赫氏法则进行致病力测定。采取无伤与有伤2种接种方式，于每个莲雾果实表面接种菌饼1个，均重复3次。

无伤接种：取PDA培养基的边缘处生长3d的病原菌，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，移到接种的部位。有伤接种：先用无菌针在同一部位进行针刺，共剌5个小孔，每孔约深0.2 mm。取PDA培养基边缘处生长3d的病原菌，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，移到接种的部位。对照：接种方式同上，接种同样大小的无菌PDA培养基到接种果实表皮。接种后于25℃条件培养观察，每隔1d记录剌伤接种病斑扩展情况。同时，接种莲雾果实发病后，从果实发病部位分离纯化出病原菌，与最初分离纯化且接种发病的菌株作对比，确认分离物的一致性。

1.2.4 显微镜观察菌丝的形态结构变化 取供试软腐病病原菌在PDA培养基上培养，在第3 d菌丝覆盖整个平板后，用5 mm打孔器取菌饼5个接入 100 mL 液体培养基中，设置处理组和对照组，处理组加入60 μL最适浓度的黄皮精油，对照组加入相对应灭菌的蒸馏水，将其置于 25 ℃、140 r/min振荡箱中培养48 h，用0.2mol/L、pH=6.5的磷酸盐缓冲液将菌丝充分去除培养基，取微量完整菌丝在显微镜下观察记录[6]。

1.2.5 相对电导率的测定 取供试软腐病病原菌在PDA培养基上培养，在第3 d菌丝覆盖整个平板后，用5 mm打孔器取菌饼5个接入 100 mL 液体培养基中，将其置于 25 ℃、140 r/min振荡箱中培养48 h，用0.2mol/L、pH=6.5的磷酸盐缓冲液将菌丝充分去除培养基[6]，设置处理组和对照组。处理组把菌丝定量加到最适浓度的黄皮精油培养基中，对照组把菌丝定量加到灭菌的培养基中。室温下放置0、1.5、3、4.5、6、7.5 h后，依照谢丽等[7-8]的方法测定电导率。

1.2.6 还原性糖含量的测定 取供试软腐病病原菌在PDA培养基上培养，在第3 d菌丝覆盖整个平板后，用5 mm打孔器取菌饼5个接入100 mL 液体培养基中，设置处理组和对照组，处理组加入60 μL最适浓度的黄皮精油，对照组加入相对应灭菌的蒸馏水，将其置于 25 ℃、140 r/min振荡箱中进行培养。样品中还原糖量的测定：参照王学奎和黄见良[9]的方法测定。

1.2.7 可溶性蛋白质含量的测定 取供试软腐病病原菌在PDA培养基上培养，在第3 d菌丝覆盖整个平板后，用5mm打孔器取菌饼5个接入 100 mL 液体培养基中，设置处理组和对照组，处理组加入60 μL最适浓度的黄皮精油，对照组加入相对应灭菌的蒸馏水，将其置于 25 ℃、140 r/min振荡箱中进行培养。样品中蛋白质含量的测定：参照王学奎和黄见良[9]的方法测定。

1.2.8 数据分析 采用Excel进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 致病性测定

通过结果可知，以针刺法接种的莲雾果实均能发病。刺伤接种3～4d后可观察到病害症状，出现白色菌丝和深色凹陷病斑，后期果肉颜色变深呈水渍状。无伤接种组发病较晚，5～6d后果实才出现明显病斑，8d后出现水渍状现象和黑色小点，相对于针刺接种发病有明显的延后。而PDA培养基接种的对照组则不发病。对发病果实进行再分离，确定了病原物的一致性。

2.2 不同浓度的黄皮精油对莲雾软腐病抑制效果

图1表明，不同浓度黄皮精油对莲雾软腐病菌丝生长的抑制程度不同。当浓度为0.6μL/mL时，对莲雾软腐病的抑制率可达到48.99%，且与其他精油浓度存在显著性差异(P<0.05)。当精油浓度为0.8μL/mL时，抑菌效果减弱，仅为33.49%，因此黄皮精油抑制莲雾软腐病的最适浓度为0.6μL/mL。

图1 不同浓度精油对莲雾软腐病的抑菌效果 注：a、b、c不同处理均值存在显著性差异(P<0.05)。

2.3 黄皮精油对莲雾软腐病菌丝显微形态结构的影响

在图2中，通过低倍镜，发现对照组菌丝生长稠密，处理组菌丝体生长稀疏；通过高倍镜，发现对照组菌丝生长正常，菌丝饱满，经黄皮精油处理的菌丝分叉、断裂变短，说明黄皮精油对莲雾果实软腐病菌丝的形态结构造成抑制，阻碍其生长发育。

2.4 黄皮精油对莲雾软腐病病原菌相对电导率的影响

如图3，从第0 h开始，对照组与处理组相对电导率均呈现上升的趋势，其中处理组相对电导率高于对照组；从1.5 h起，处理组相对电导率变化幅度大于对照组，说明处理组的变化趋势大于对照组；在4.5 h时处理组的相对电导率达到44.10 μs/cm，显著大于对照组的电导率，两者存在极显著性差异(P<0.01)。实验结果表明，经过黄皮精油处理的软腐病病原菌的相对电导率大于对照组。

2.5 黄皮精油对莲雾软腐病病原菌还原性糖的影响

通过图4可知，从第0h开始，处理组与对照组还原性糖含量的变化趋势均是先下降后上升，24～48 h时还原性糖含量急剧下降，48 h时对照组的还原糖含量为332.75 μg/mL，而处理组还原糖浓度为349.15 μg/mL，两者之间存在显著性差异(P<0.05)，这说明培养基中

图2 黄皮精油对莲雾软腐病菌丝形态的影响注：A：空白对照菌丝×20；B：空白对照菌丝×40；C：处理菌丝样品×20；D：处理菌丝样品×40

图3 黄皮精油对莲雾软腐病相对电导率的影响

图4 黄皮精油对莲雾软腐病病原菌还原糖的影响

图5 黄皮精油对莲雾软腐病病原菌可溶性蛋白含量的影响

营养物质消耗严重，菌丝生长达到顶峰；48～96 h处理组还原糖含量持续上升，在72h时达到最大值。经过持续的下降后，在72～96 h对照组含量呈现上升的趋势。

2.6 黄皮精油对莲雾软腐病病原菌可溶性蛋白质含量的影响

由图5可知，从第0h开始，处理组与对照组可溶性蛋白含量逐渐降低；24 h时处理组与对照组可溶性蛋白质含量出现差异，处理组开始升高，而对照组含量持续降低，在48h时处理组可溶性蛋白含量为10.88μg/mL，而对照组含量仅为1.02 μg/mL，两者存在显著性差异(P<0.05)。

3 结论与讨论

陈前等[9-11]运用形态学和分子生物学对莲雾病原菌进行了鉴定并研究其病原菌的生物学特性，证明了莲雾果实软腐病病原菌有比较强的适应能力和生存能力。Prasad KN 等发现，黄皮中的香豆素类化合物具有很好的抗氧化活性；本次实验分离纯化出莲雾果实上的软腐病并进行抑菌活性测定，采取菌丝生长速率法对黄皮精油进行抑菌测定和利用显微镜对菌丝进行观察，实验证明：黄皮精油对软腐病病原菌有抑制作用，且不同浓度的精油对菌丝有不同的抑制程度，最适精油浓度为0.6μL/mL；此外，大于0.8μL/mL的精油浓度反而使抑菌效果减弱。

菌丝在不同条件下培养，菌丝的结构、生长速度等特征存在一定的差别，菌丝的显微结构也会发生细微的变化[11，14，16]。通过显微观察菌落的形态结构，发现经0.6 μL/mL的黄皮精油处理后的菌丝体生长稀疏，菌丝体数量减少，分支较少，说明黄皮精油对莲雾软腐病菌丝的形态结构具有明显的破坏效果，即黄皮精油对其生长具有抑制作用。当病原菌遇到抑制生长作用时，细胞膜结构遭到破坏，进而菌体的保护被打破，其内部电解质会渗入到培养液中，导致培养液的电导率升高，因此验证0.6 μL/mL的黄皮精油对莲雾果实软腐病的抑制效果，可以通过培养液中电导率的变化来反应。试验结果表明，处理组的电导率总体呈现上升的变化趋势且远远大于对照组，说明黄皮精油对菌丝细胞膜具有破坏作用，胞内离子的外渗导致电导率的上升。

还原性糖和可溶性蛋白是病原菌能量的来源，试验结果表明，处理组菌丝的细胞膜结构受到黄皮精油破坏，胞内物质的外渗造成中后期蛋白含量和还原糖含量呈现上升的趋势，证明了黄皮精油对莲雾软腐病原菌具有一定的抑制作用。而对照组在后期蛋白含量和还原糖含量的上升，是由于菌丝呈现负生长，细胞大量死亡，胞内物质释放造成。

综上来看，从叶子中提取的黄皮精油具有较好的抑菌活性，再加上黄皮是我国普遍存在且非常易得的植物，开发成本低廉，在资源开发和果蔬保鲜技术方面具有较大的应用价值和发展前景。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Inhibition Mechanism of Essential Oil ofClausenalansiumfor Soft Rot of Wax-apple Fruits

ZHANG Shi-qing，ZHONG Man-xi，ZENG Feng，CONG Xin-li

(College of Horticulture and Landscape，Hainan University，Haikou 570228，China)

Taking‘Heijingang’wax apples as the test object，the soft rot pathogen has been separated and purified after harvesting the wax apple fruit.Based on the testing result of anti-fungal activity of the essential oil(EO)extracted from the foliage ofClausenalansiumagainst soft rot，we analyzed influence of such essence oil on both the form and structure of mycelia to probe into the antibacterial mechanism of essential oil ofClausenalansium.The results showed all essential oil ofClausenalansiumof different concentrations displayed antibacterial effects over the testing soft rot and the inhibition rate of 0.6 μL/mL EO reached 60.62%.The mycelium processed with 0.6 μL/mL EO was sparse with less branches.Essential oils ofClausenalansiumhad significant impacts over the permeability of pathogenic fungus membrane，which reduced the content of soluble protein and reducing sugar and hindered the fungus’s absorption of nutrients.To conclude，we identified the antibacterial mechanism of essential oils ofClausenalansiumpreliminarily and found 0.6 μL/mL EO had the best antibacterial effect.

wax apple；soft rot；Clausenalansium；essential oil；antibacterial effect

海南省重点研发计划项目(项目编号：ZDYF2016090)。

张史青(1991— )，男，硕士，研究方向：果蔬采后生理与贮藏技术。

从心黎(1980— )，女，博士，副教授，研究方向：果蔬采后生理与贮藏技术。