泌尿系统感染革兰阴性杆菌的病原学分布及耐药表型

李文波， 高 武， 王周宝， 杨娅娅， 张玉娟

·论著·

泌尿系统感染革兰阴性杆菌的病原学分布及耐药表型

李文波， 高 武， 王周宝， 杨娅娅， 张玉娟

目的探讨甘肃省第二人民医院2014－2015年泌尿系统感染革兰阴性杆菌病原学及产β内酰胺酶菌株的检出率和耐药性，为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法采用手工法和鉴定仪系统对菌种进行鉴定，用琼脂扩散法进行药敏检测，采用三维试验进行耐药酶检测，根据2012年CLSI标准进行判读。结果临床泌尿系统感染分离出革兰阴性菌987株，其中大肠埃希菌509株、肠杆菌属细菌109株、铜绿假单胞菌104株、肺炎克雷伯菌98株、奇异变形杆菌92株、弗劳地枸橼酸杆菌46株和其他革兰阴性杆菌29株，分离率分别为51.6 %、11.0 %、10.5 %、9.9 %、9.3 %、4.7 %、2.9 %。共检出单产ESBL菌株494株（50.1 % ），初筛试验检出可疑产AmpC酶细菌243株，经三维试验确证产AmpC酶细菌135株（13.7 %），同时产ESBL和AmpC酶菌株16株（1.6 %），产ESBL菌株以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为主，检出率分别为79.6 %、34.6 %、37.8 %，未检出金属酶及KPC酶。革兰阴性杆菌对β内酰胺类抗生素耐药情况严重，总耐药率最低的是亚胺培南（0.02 %）、阿米卡星（10.6 %）、头孢哌酮-舒巴坦（23.8 %）和呋喃妥因（25.2 %）。大肠埃希菌对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率分别为89.8%、91.8 %，革兰阴性杆菌对头孢菌素有不同程度的耐药。结论泌尿系统感染的病原菌主要以大肠埃希菌为主，产β内酰胺酶的检出率和耐药率均很高，亚胺培南、阿米卡星、头孢哌酮-舒巴坦、呋喃妥因具有较强的体外抗菌活性。

革兰阴性杆菌 ；泌尿系统感染； β内酰胺酶 ；抗菌药物；耐药率

泌尿系统感染发生率仅次于呼吸系统感染。尿频、尿急、尿痛及排尿困难等是其临床常见的主要症状，严重者可引发肾损伤或发展为血流感染。老年及有基础疾病、女性尿道解剖结构、长期住院、卧床等为易感因素[1-2]。革兰阴性杆菌是泌尿系统感染的常见病原菌，随着β内酰胺类抗生素广泛使用。细菌耐药越来越严重，耐药菌株不断增加，呈现多重耐药趋势[3]。产β内酰胺酶是革兰阴性杆菌最重要的耐药机制。其中主要为染色体和质粒介导的持续高产Ⅰ型β内酰胺酶（AmpC酶）和Ⅱ型中的超广谱β内酰胺酶（ESBL）[4]。动态监测泌尿系统感染病原菌分布及产酶耐药情况，可帮助临床医师了解本地区细菌耐药现状及变迁，为临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 对本院2014－2015年送检的临床尿标本进行培养，菌种鉴定按第3版《临床微生物学和微生物检验》[5]进行分离，并鉴定到种，共分离出菌株 987株。

1.1.2 仪器和培养基 微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪），MH培养基购于杭州天河微生物试剂有限公司。

1.1.3 抗菌药物纸片 头孢唑林、哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢哌酮-舒巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢西丁、 亚胺培南、呋喃妥因、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星均由杭州天河微生物试剂有限公司提供，经质控检验合格使用。

1.1.4 质控菌株 药敏试验用标准菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603（ESBL阳性质控菌）均购于甘肃省人民医院检验中心。

1.2 方法

1.2.1 分离及菌株鉴定 接种血平皿、麦康凯平皿，35 ℃孵育24 h分纯菌落，根据革兰染色、生化反应等进行鉴定，必要时用微生物鉴定仪鉴定。泌尿道感染判断标准：清洁尿培养革兰阴性杆菌菌落计数≥105cfu / mL。

1.2.2 药敏试验 耐药酶检测及药敏结果均按CLSI 2012标准进行判读[6]。

1.2.3 耐药酶检测

1.2.3.1 酶粗提液制备[7]待测菌于肉汤中增菌，接种于MH培养基37 ℃孵育24 h，刮取菌落于生理盐水中制成菌悬液，-20 ℃反复冻融5次后，12 000 r / min离心60 min取上清液即为β内酰胺酶粗提液。用头孢硝噻吩纸片检测β内酰胺酶，纸片变红即为阳性。

1.2.3.2 采用改良三维法 三维试验[8]，将可疑的待测菌挑取于肉汤中，冻融5次；在涂抹了大肠埃希菌ATCC 25922的MH平皿上贴头孢噻肟药敏纸片1张，用刀片在其周围切4个切口分别编号，1号切口中加入冻融后的酶粗提液30 µL，2号切口加入30 µL酶粗提液和10 µL克拉维酸液（2 mmol / L），3号切口加入30 µL酶粗提液和10 µL氯唑西林液（2 mmol / L），4号切口加入30 µL酶粗提液和10 µL氯唑西林液（2 mmol / L）和10 µL克拉维酸液（2 mmol / L），37 ℃孵育24 h后，观察切口内侧周围有无细菌生长。若在切口与头孢噻肟药敏纸片的交界处出现矢状细菌生长判为三维试验阳性。若此处不出现矢状细菌生长判为三维试验阴性。

1.2.3.3 三维试验药敏试验结果判断 根据ESBL能被酶抑制剂克拉维酸抑制，不被氯唑西林抑制；而AmpC酶则不能被酶抑制剂克拉维酸抑制，能被氯唑西林抑制 ，1、2号阳性，3、4号阴性为单产AmpC酶，1、3号阳性，2、4号阴性为单产ESBL，1、2、3号阳性，4号阴性为产ESBL+AmpC酶，1、2、3、4号均阴性为不产酶。如图1所示。

2 结果

2.1 革兰阴性杆菌构成

临床泌尿系统感染革兰阴性菌主要以大肠埃希菌为主，占总分离率51.6 %，分离前5位菌分别是大肠埃希菌、肠杆菌属细菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌 。见表1。

图1 改良三维试验Figure 1 Modifed three-dimensional test to detect betalactamases

表1 革兰阴性杆菌分布Table 1 Distribution of the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections

2.2 革兰阴性杆菌产酶菌株检测

革兰阴性杆菌中，检出产ESBL菌株以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为主，分别占各自分离菌的79.6 %、37.8 %、34.6 %，总检出率为50.1 %。初筛试验（头孢西丁药敏纸片抑菌圈直径＜16 mm）检出可疑产AmpC酶细菌243株，经三维试验确证单产AmpC酶细菌135株，以铜绿假单胞菌、肠杆菌属细菌、弗劳地枸橼酸杆菌为主，铜绿假单胞菌产ESBL+AmpC酶16株，见表2。

表2 革兰阴性杆菌产酶菌株检测Table 2 Profle of ESBLs and AmpC beta-lactamases production in the gram-negative bacteria isolated from urinary tract infections

2.3 革兰阴性杆菌耐药率

革兰阴性杆菌对β内酰胺类抗生素耐药性严重，总耐药率最低的是亚胺培南、阿米卡星、头孢哌酮-舒巴坦、呋喃妥因，耐药率分别为0.02 %、10.6 %、23.8 %、25.2 %。大肠埃希菌对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率为89.8%、91.8 %，革兰阴性杆菌对头孢菌素有不同程度的耐药， 见表3。

3 讨论

泌尿系统感染是临床常见病、多发病，严重者可导致血流感染，肾功能不全，住院期间经常导尿、持续导尿、留置导尿管患者尤其容易发生尿路逆行感染[9]。本研究泌尿系统感染中大肠埃希菌的分离率最高，达51.6 %。随着新药的出现和大量频繁使用，大多数菌株耐药率逐年增加，并出现了大量产酶菌株，产ESBL革兰阴性杆菌感染一直是泌尿系统感染治疗中的难点。产ESBL细菌存在于革兰阴性杆菌中，多见于肠杆菌科细菌[10]。 本院泌尿系统感染患者987株革兰阴性杆菌中，产ESBL菌株检出率为50.1 %（494 / 987），以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为主，检出率占各自菌的79.6 %、37.8 %、34.6 %。产AmpC酶细菌检出率为13.7 %（135 / 987），其中铜绿假单胞菌为63.5 %、肠杆菌属细菌为49.5 %、弗劳地枸橼酸杆菌为17.4 %，未检出金属酶及KPC酶。各地区产耐药酶的细菌分离率不尽相同，应加强对所有革兰阴性杆菌进行耐药酶的检测。产ESBL菌株对大多数抗菌药物耐药，尤其对 β内酰胺类抗生素显示高度耐药，对氨基糖苷类、喹诺酮类等抗菌药物的耐药率也较高，治疗十分困难。在体外药敏试验中，亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦、氨基糖苷类药物、呋喃妥因、头孢西丁对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗劳地枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌均有很强的抗菌活性，肠杆菌属细菌、铜绿假单胞菌对头孢哌酮-舒巴坦、头孢西丁的耐药率稍高，是因为其产AmpC酶比例较高的缘故，产AmpC酶菌株对所有第三代头孢菌素类及酶抑制剂类药物100 %耐药。大肠埃希菌对头孢菌素、喹诺酮类抗菌药物的敏感率明显下降，对头孢菌素类药物耐药率均高于80 %，对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率在89.8 %～91.8 %。铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药率较高，除亚胺培南、阿米卡星外，对其余抗菌药物的耐药率＞40 %。因此，在治疗泌尿系统感染时，必须及时送检标本进行病原菌培养及药敏试验，做到合理规范使用抗菌药物，重视产ESBL和AmpC酶菌株的监测情况，定期对检测结果进行分析，及时与临床沟通，采取有效措施减少耐药菌株的传播。

表3 主要革兰阴性杆菌对常用抗菌药物的耐药率Table 3 Resistance rate of gram-negative isolates to commonly used antimicrobial agents [n（ %）]

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Antimicrobial resistance profile of the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections

LI Wenbo, GAO Wu, WANG Zhoubao, YANG Yaya, ZHANG Yujuan. （Department of Laboratory Medicine, the Second People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China）

ObjectiveTo investigate the antimicrobial resistance and beta-lactamase production profle in the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections in the Second People’s Hospital of Gansu Province during the period from 2014 to 2015. The results will provided to clinicians for better antimicrobial treatment.MethodsThe bacterial isolates were identifed via conventional laboratory tests or automatic identifcation systems and subjected to antimicrobial susceptibility testing by using Kirby-Bauer method. Three-dimensional test was used to detect the enzymes conferring antimicrobial resistance. The susceptibility testing results were interpreted according to the CLSI breakpoints issued in 2012.ResultsA total of 987 gram-negative strains were isolated from urinary tract infections, including E. coli (51.6 %, 509 / 987), Enterobacter (11.0 %, 109 / 987), P. aeruginosa (10.5 %, 104 / 987), K. pneumoniae (9.9 %, 98 / 987), P. mirabilis (9.3 %, 92 / 987), C. freundii (4.7 %, 46 / 987), and other gram-negative bacilli (2.9 %, 29 / 987). ESBLs were produced in 494 (50.1 %) of the 987 strains of gram negative bacilli. Preliminary screening test identifed 243 AmpC beta-lactamases producing strains, and 135 (13.7 %) strains were confrmed by three-dimensional test. Both ESBLs and Amps beta-lactamases were produced in 16 (1.6 %) strains. The prevalence of ESBLs-producing strains was 79.6 % in E. coli, 34.6 % in P. aeruginosa and 37.8 % in K. pneumoniae isolates. Metallo-β-lactamase or KPC beta-lactamase was not identifed. The antimicrobial resistance was serious in gramnegative bacilli, which showed relatively low resistance rate to imipenem (0.02 %), amikacin (10.6 %), cefoperazone-sulbactam (23.8 %), and nitrofurantoin (25.2 %). E. coli prevalence of levofoxacin, ciprofoxacin resistance respectively were 89.8%, 91.8%. The gram-negative bacilli from urinary tract also showedvarious levels of resistance to cephalosporins.ConclusionsThe gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections are mainly E. coli. The gram-negative isolates show high level antimicrobial resistance and high prevalence of beta-lactamases. Imipenem, amikacin, cefoperazone-sulbactam, and nitrofurantoin still have very high antibacterial activity against these isolates in vitro.

gram negative bacilli; urinary tract infection; beta-lactamase; antibacterial agent; antimicrobial resistance

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0167-04

10.16718 / j.1009-7708.2017.02.009

2016-05-20

2016-08-17

甘肃省第二人民医院检验科，兰州 730000。

李文波（1968—），女，本科，副主任检验技师 , 主要从事微生物感染学研究。

李文波，E-mail：lwbcz2015@sina.com。