液相色谱-质谱联用技术的研究进展

许海舰，刘翠哲

（承德医学院中药研究所/河北省中药与开发重点实验室，河北承德 067000）

液相色谱-质谱联用技术的研究进展

许海舰，刘翠哲△

（承德医学院中药研究所/河北省中药与开发重点实验室，河北承德 067000）

液相色谱-质谱联用（LC-MS）；基本原理；应用进展

20世纪70年代，液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术 开始出现，当时的场解吸（FD）离子化技术虽然能测定分子量1500～2000Da的非挥发性物质，但重复性差。后来出现的快原子质谱法（FAB-MS），对分子量较大的多肽类化合物测定效果良好。随着现代科学技术的发展，更加精密的化合物分析质谱法—电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和大气压化学电离源质谱法（APCI-MS）应运而生。本文对近年来LC-MS的研究应用进行综述。

1 质谱仪器

1.1 质谱分析法的基本原理 质谱分析法是将物质离子化，并按照质荷比分离，通过测量各离子峰的强度达到分析目的。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标，所作的条状图就是常见的质谱图。

1.2 质谱仪的组成

1.2.1 真空系统：由机械真空泵、扩散泵或分子泵组成，以抽取离子源和分析器等部分的真空。只有真空度足够高，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度降低。

1.2.2 进样系统：是将所分析的样品导入离子源的装置，包括直接进样、加热进样和参考物进样等。

1.2.3 离子源：是使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)，同时对带电粒子加速，使其进入分析器的装置，目前使用的离子源主要是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。（1）ESI：样品流出毛细管喷口，在雾化气（N2）和强电场（3-6kV）的作用下迅速雾化，产生高电荷液滴，伴随液滴挥发电场也随之加强，此时离子移至液滴表面并挥发，产生单电荷或多电荷离子。一般生物大分子产生多电荷离子，小分子得[M+H]+或[M-H]-单电荷离子。（2）APCI：样品流出毛细管，通过氮气流雾化到加热管中被挥发，加热管Corona尖端放电电极使溶剂分子形成反应气等离子体，样品分子和等离子体通过氢质子交换被电离，形成[M+H]+或[M-H]-进入质谱仪。

1.2.4 质量分析器：现有的质量分析器有串联四极、三重四极杆分析器等。

1.2.5 检测接收器：是接收离子束流的装置，包括电子倍增器、光电倍增器和微通道板。

2 LC-MS分析条件的选择

2.1 离子源的选择 ESI是最软的电离技术，适合分析中极性、强极性化合物分子，尤其是在溶液中能预先形成离子的化合物和可获得多个质子的大分子。APCI亦为软电离技术，适合分析弱极性小分子物质，不适合分析带多个电荷的大分子。

2.2 正、负离子模式的选择 正离子模式用于分析碱性样品，样品由甲酸或乙酸酸化后进行分析。样品中含仲氨或叔氨的应优先考虑使用正离子模式。负离子模式用于分析酸性样品，由三乙胺或氨水碱化样品后分析，适合分析含较多强伏电性基团的样品，如含氯、含溴或多个羟基时可尝试使用负离子模式。

2.3 流动相的选择 常用的流动相为甲醇、乙腈、水及不同比例的混合物，或一些易挥发盐的缓冲液，还可通过加入酸、碱调节pH值。LC-MS接口须避免进入不挥发性、含磷和氯的缓冲液；流动相中含钠和钾的成分应＜lmmol/L，醋酸铵＜5mmol/L，甲酸＜2%、三乙胺＜l%、三氟乙酸0.5%。进样前，为达到基本分离，应摸好液相条件，且缓冲体系应符合质谱要求。

2.4 流量和色谱柱的选择 不加热ESI目前一般用lmm～2.1mm内径微柱，最佳流速(1～50)μl/min；采用内径4.6mm的LC柱时要求柱后分流。APCI常规使用直径4.6mm的色谱柱，最佳流速lml/min；小于100mm的短柱可提高分析效率，节省定量分析的时间。

3 LC-MS的应用进展

3.1 杂质的分析 药物在生产、运输和保存过程中，容易引入或自身产生无治疗作用、影响药物稳定性和疗效的杂质，甚至对人体健康有害的物质。杂质通常量低、种类多，结构和主药类似，很难检测。杂质的一般检测方法有TLC、HPLC、NMR和IR，但灵敏度低，在杂质控制方面的应用受到限制[1]。LC-MS联用技术结合了色谱的高分离性和质谱的高灵敏度、高选择性，能提供相对分子质量与结构信息，极大地推动了杂质研究的发展[2]。

头孢菌素是最常用的抗生素，具有高效、低毒的特点[3]。头孢菌素中的β-内酰胺环结构不稳定，在生产和运输过程中易产生一系列降解产物和聚合物，从而失去抗菌活性，甚至产生毒性，在生产过程中要严格控制杂质的量。LC-MS联用技术在头孢菌素降解产物[4]、食品中残留物[5]和生物样品中代谢产物[6-7]等检测方面取得了长足的进步。Rourick等[4]人用液相串联质谱（LC-MS/MS）法考察了在酸、碱等不同条件下头孢羟氨苄的降解规律，解析了可能的降解产物的结构，包括△3-异构体、7S构型的差向异构体、开环物、哌嗪二酮衍生物、头孢羟氨苄亚砜等。

随着LC-MS联用技术的发展，其在杂质谱分析中的应用更加广泛，尤其是原料药杂质谱的分析，在对药物中存在的已知杂质进行鉴别的同时，也可推导未知杂质的结构。杨昊等[8]用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用（HPLC-ESI-IT-MSn）法建立了庆大霉素Cla杂质谱的分析方法，结果显示庆大霉素Cla可与主要杂质分离，并从庆大霉素Cla的原料中检测出13个杂质，解析了其中12个杂质的结构，主要是庆大霉素A、B、小诺霉素、西索米星、威达米星或其同分异构体和同系物，以及庆大霉素Cla和上述杂质的降解产物。

飞行时间质谱仪（TOF-MS）为高灵敏度、高选择性的高分辨质谱，能得到高质量质谱图，以及化合物的精确相对分子质量，适合大分子化合物的分析[9]。崔宏霞等[10]建立了液相高分辨飞行时间质谱（LC-TOF/HR-MS）法，按照英国和美国药典规定的可能有关物质进行结构对比，初步鉴定了氯吡格雷的18个主要杂质的结构，且将杂质分成了4类。Wang等[11]用液相飞行质谱-离子阱质谱（LC-TOF/MS-IT/MS）法对罗红霉素中19个杂质进行研究，通过对质谱碎片的分析，归属了所有杂质的结构。Adouani等[12]在地奥司明有关物质研究中，根据LC-MS和四级杆-飞行时间（Q-TOF）质谱法的结果，推断出了一种新杂质。Raman等[13]采用LC-MS/MS和液相-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-TOF/MS）法对依折麦布制备工艺中产生的杂质I进行了初步分析，推测其结构为2-(4-邻羟苄基)-N，5-顺-(4-氟代苯基)-5-羟基戊酰胺，并用NMR和IR进一步确证。

3.2 药代动力学研究 药物动力学研究需对生物样品中微量乃至痕量成分作定量分析。目前，药物的研制趋于低剂量，采用常规的分离检测技术很难准确定量复杂介质中的痕量成分。LC-MS技术为体内药物分析中的药代动力学、药物代谢的研究提供了一种高效、可靠的分析手段。

尼莫地平为1，4-二氢吡啶类钙离子拮抗剂，对脑组织受体有高度选择性，容易透过血脑屏障，能通过有效地阻止钙离子进入细胞内、抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛的目的，从而保护脑神经元、稳定脑神经元的功能及增进脑血灌流，改善脑供血，提高脑组织对缺氧的耐受力。吴华等[14]建立了测定人体血浆中尼莫地平含量（尼群地平为内标）的LC-MS法，研究20名健康男性志愿者口服尼莫地平受试制剂和参比制剂后的药物动力学，为临床用药提供指导。

羟基红花黄色素A[15]（hydroxysafflor yellow A）是具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效最高的水溶性部位，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，竞争性抑制血小板激活因子与血小板受体的结合。李长印等[16]建立了液相色谱-串联三重四极杆质谱（SPE-LC-MS/MS）法测定人血浆中羟基红花黄色素A（QA）浓度的分析方法。

头孢克肟（Cefixime）为口服第三代头孢菌素类抗生素，主治敏感菌所致呼吸、泌尿和胆道等部位的感染。为研究头孢克肟是否适合联用其它药物用于口腔科感染性疾病，黄开明等[17]建立了LC-MS/MS法测定大鼠尾静脉注射头孢克肟后不同时间点在口腔组织分布情况和药动学特征，以期为临床规范、合理用药提供理论依据。

体内一氧化氮与活性氧反应生成的过氧亚硝基阴离子，可影响体内蛋白、脂质和DNA的硝化和氧化，且极不稳定，很难定量。据报道，过氧亚硝基阴离子能与游离或结合型色氨酸反应，生成3-硝基色氨酸，稳定性良好，故3-硝基色氨酸被广泛用作体内产生活性氮的生物标记。但硝基化色氨酸量的增加，会影响相关蛋白和细胞的功能，并引发多种代谢性疾病。同时，各组织中的3-硝基色氨酸量低，含量差异大，在体内很难对其准确定量。Li等[18]建立了用LC-MS/MS测定3-硝基色氨酸的分析方法，实现了对色氨酸和3-硝基色氨酸的分离。

4 展望

LC-MS联用技术结合了色谱的高分离性和质谱的强鉴别力，专属性高，对多数药物的检测灵敏度优于其它分析方法，定量测试速度亦明显加快。该技术可解析混合物中微量组分的结构，达到现代体内药物分析研究中高通量和高精度的要求，成为了药代动力学和药物代谢研究的核心分析技术。随着现代高新技术的不断发展，LC-MS联用技术必将在体内药物分析的研究中拥有不可或缺的地位。

[1]张静霞，徐明琴，张春然，等.抗生素杂质的检测方法研究进展[J].中国新药杂志，2012，2（113）：1498-1502.

[2]苏靖，戴荣继.液质联用技术在中药研究中的应用[J].生命科学仪器，2014，1（22）：38-42.

[3]屈伟红.头孢菌素类药物不良反应发生原因的临床分析[J].医学理论与实践，2011，2（49）：1047-1048.

[4]Rourick RA,Volk KJ,Klohr SE,et al.Predictive strategy for the rapid structure elucidation of drug degradation[J].J Pharm Biomed Anal,1996,14(12):1743-52.

[5]Riediker S,Stadler RH.Simultaneous determination of fi ve beta-lactam antibiotics in bovine milk using liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass pectrometry[J].Anal Chem,2001,73(7):1614-21.

[6]Niessen WM.Analysis of antibiotics by liquid Chromatography-mass spectrometry[J].J Chromtogr A,1998,812(1-2):53-75.

[7]HeHer DN,Kaplan DA, Runmmel NG, et al. Identification of cephapirin metabolites and degradants in bovine milk by elesctrospray ionization-ion trap tandem mass spectrometry[J].J Agric Food Chem,2000,48(12):6030-35.

[8]杨昊，袁耀佐，赵恂，等.用HPLC-ESI-IT-MSn法研究庆大霉素Cla的杂质谱[J].药学与临床研究，2012，2（05）：413-418.

[9]钱疆，杨芳，陈弛，等.超高效液相色谱飞行时间质谱测定食品中36种合成色素[J].食品科学，2013，3（46）：215-218.

[10]崔宏霞，宋敏，杭太俊.氯雷他定有关物质的液质联用鉴定[J].药学与临床研究，2013，2（15）：505-512.

[11]Wang F, Zeng H X, Wang J. Characterization of Nineteen impurities in roxithromycin by HPLC/TOF and ion trap mass spectrometry[J].Chromatographia,2013,76(23):1683-1695.

[12]Adouani I,Du M,Hang TJ,et al.Identi fi cation and determination of related substances in diosmin bulk drug and pharmaceutical formulations by HPLC and HPLC-M [J].Chromatographia,2013,76(9):499-508.

[13]Raman B,Sharma B A,Butala R,et al.Structural elucidation of a process-related impurity in ezetimibe by LC-MS/MS and NMR[J].J Pharm Biomed Anal,2010,52(1):73-78.

[14]吴华，朱莹，潘世芬，等.人血浆中尼莫地平的LC-MS/MS法测定及其药物动力学[J].中国工业杂志，2008，3（91）：39-41.

[15]杨小虎，王丹丹，朱彦.羟基红花黄色素A的现代研究新进展[J].湖南中医药大学学报，2013，3（33）102-106.

[16]李长印，储继红，张军，等.LC-MS/MS法测定人血浆中羟基红花黄色素A的浓度[J].中国药理学通报，2014，30（10）：1402-1407.

[17]黄开明，梁金凤，陈清霞，等.LC-MS/MS测定头孢克肟在大鼠口腔组织的分布与药代动力学研究[J].今日药学，2013，23（9）：592-599.

[18]Li XS,Li S,Kellermann G.A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker[J].Talanta,2015,140:45-51.

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2017-03-26）