EphA2与VEGF-C在胃癌中的表达及其与淋巴管生成的关系

朱振华，袁伟杰，黄昌浩，陈子华

（1. 湖南省长沙市中心医院 普通外科，湖南 长沙 410004；2. 中南大学湘雅医院 普通外科，湖南 长沙 410008）

胃癌是亚洲最常见的消化道恶性肿瘤，约占全球范围癌症死亡的10%以上，仅次于肺癌[1]。淋巴结转移是影响胃癌患者预后的重要因素[2]，但是促进胃癌淋巴道转移的淋巴管生成机制还不明了。EphA2已被证实在胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中明显过表达，并且与肿瘤微血管密度及患者预后密切相关[3]。VEGF-C是近年来发现的淋巴管内皮生长因子，其与受体VEGFR-3结合后可发生淋巴管内皮扩张，促使淋巴管形成[4]。为探究EphA2和VEGF-C两种蛋白在胃癌淋巴道转移中关系，本实验利用免疫组化SP法和real-time PCR方法分别检测EphA2与VEGF-C蛋白和mRNA在胃癌组织中的表达及两者相关性，同时用特异性淋巴管内皮标记物D2-40对淋巴管进行染色后分析EphA2和VEGF-C的表达对淋巴管生成的影响，为进一步抗肿瘤淋巴管生成的分子靶向治疗提供临床研究依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集82例中南大学湘雅医院自2012年12月—2013年6月收治的胃癌患者的癌组织及其距肿瘤边缘约2 cm的癌旁正常组织。所有患者术前均未行任何治疗，其中女36例，男46例；年龄分布31～81岁，中位年龄5.5岁；淋巴结转移者52例，无淋巴结转移者30例；按照国际抗癌联盟UICC 1997年TNM分期标准分期：I～II期40例，III期42例。

1.2 试剂

兔抗人EphA2多克隆抗体购自美国Millipore公司；兔抗人VEGF-C多克隆抗体和小鼠抗人D2-40单克隆抗体英国Abcam公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；逆转录试剂盒（GoScript TM Reverse Transcription System）购自美国Promega公司；SYBR Green购自瑞士Roche公司；引物由由上海生物生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本处理 82例标本均由10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。蜡块切片，做免疫组织化学染色。所有石蜡标本（包括NK、RCCC）均连续切片，片厚约4 μm，共5张。其中1张作常规HE染色，3张作EphA2、VEGF-C、D2-40免疫组化染色，1张以PBS液代替一抗体作为阴性对照。随机抽取20例胃癌患者术后留取的新鲜标本进行real-time PCR。每例患者手术后30 min内取胃癌组织以及癌旁2 cm新鲜组织标本，同时随机选取2例患者远离肿瘤组织（＞10 cm）的新鲜标本作为PCR阴性对照。所有标本放入已消毒的经1%DEPC水溶液处理过的EP管中，并迅速转移至-80 ℃低温冰箱中，供后续试验用。

1.3.2 免疫组化染色（SP二步法） 4 μm厚石蜡切片在65 ℃恒温箱中烘烤90 min后常规脱蜡以及水化，用3%H2O2室温下15 min消除内源性过氧化物酶，PBS漂洗 3次，每次 5 min；于 0.01 mol/L pH6.0 柠檬酸钠缓冲液中，用微波法进行抗原修复；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μL 3%BSA，37 ℃水浴箱孵育30 min；弃去封闭液，分别滴加1:100稀释的兔抗人EphA2多克隆抗体和兔抗人VEGF-C多克隆抗体以及1:150稀释的小鼠抗人D2-40单克隆抗体，37 ℃孵育1 h，用PBS代替一抗作阴性对照；PBS漂洗3次，每次5 min；分别滴加抗兔和抗鼠二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗 3 次，每次 5 min。DAB 显色 1～5 min，显微镜下观察染色情况，自来水冲洗2 min终止染色；苏木素复染细胞核20 s，常规脱水透明，中性树胶封片。

1.3.3 RNA提取和cDNA分析 TRIzol法提取总RNA。取100 mg组织置于盛有液氮的研钵中碾碎后加入1 mL TRIzol于继续碾磨成粉状，室温冷却后转移至 1.5 mL EP 管；1 1000r/min 4 ℃离心10 min后取上清至新的1.5 mL EP管。每管加入0.2 mL 氯仿，震荡 15 s混匀后室温放置 5 min，11 000r/min 4 ℃离心 15 min。吸取含总 RNA 的上层无色水相至一新的离心管中，每管加入等体积异丙醇，颠倒数次混匀，冰上静置 10 min 后 11 000r/min 4 ℃离心 10 min，弃上清。加入 1 mL 75% 乙醇（DEPC 水配制），颠倒混匀后 6 000r/min 4℃离心5 min。弃尽上清。待乙醇挥发干净后，加入适量DEPC水溶解，10 μL分装后，-70℃冻存。取OD260/OD280比值范围在1.8～2.0之间的RNA进行下一步实验。逆转录合成 cDNA：1 μL Oligo dT和1 μL总RNA加入到PCR小管中，补充DEPC水至 10 μL，混匀后，70 ℃ 5 min。按照逆转录试剂盒说明配置10 μL反应体系，混匀离心后42 ℃反应 1 h，然后 70 ℃ 10 min，将所得的 cDNA 置于-80 ℃保存备用。

1.3.4 real-time PCR 采用SYBR Green法进行real-time PCR。采用 primer 5.0 软件设计引物，VEGF-C 正 向：AAG GAG GCT GGC AAC ATA AC；VEGF-C 反 向：CCA CAT CTG TAG ACG GAC AC；EphA2 正向：GTG TAC AAG GGC ATG CTG AA；EphA2 反向：AAC TTG TCC AGG GCC CCA TT；β-actin 正 向：ACA GAG CCT CGC CTT TGC；β-actin 反向：ATC CTT CTG ACC CAT GCC CAC。按 照 10 μL SYBR Green、5 μL 稀 释 5倍的 cDNA、0.4 μL 正反向引物混合液和 4.6 μL DEPC水配置反应体系。按照95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s；60 ℃ 1 min 进 行 40个循环；95 ℃5 s后，60 ℃ 1 min 的程序在 ABI7500 荧光定量PCR仪进行PCR扩增。

1.3.5 结果判断 ⑴ 免疫组化染色结果判定：EphA2与VEGF-C均为细胞浆表达的蛋白，因此阳性染色为胞浆内出现棕黄色染色，低倍镜下观察整个切片，分散选取5个不同的视野，高倍镜下观察细胞染色情况；综合阳性细胞百分率和染色强度进行结果判定。结果判定参照文献[5]报道，阳性细胞百分数≤5%为0分；6%～25%为1分，26～50%为2分；＞50%为3分。染色强弱计分，阴性为0分；淡黄色染色为1分；中度黄色染色为2分；棕黄色染色为3分。按“阳性细胞+染色强弱”计总分，0～1分为阴性（-），2分为弱阳性（+），3～4分为中度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。阴性和弱阳性为低表达组，中度阳性和强阳性为高表达组。所有染色结果的判定均采用统一评分标准和双盲法，在完全不知样本临床资料的情况下，由两名研究者分别对实验结果进行评判、打分，所有评分过程均重复3次以上。⑵ 淋巴管密度（LVD）计数：对D2-40染色阳性淋巴管进行LVD计数。参照MEIDNER计数标准，每个标本先在光镜低倍视野下（10×4）确定组织中淋巴管最密集区及热点，再在高倍镜下（10×20）下观察着色腔，以此作为一个淋巴管，计数5个视野淋巴管数目并取其均数为肿瘤LVD的数量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0版统计软件对实验数据进行统计分析。比较EphA2蛋白和VEGF-C蛋白在胃癌、癌旁组织组间差异的显著性采用χ2检验，EphA2蛋白和VEGF-C蛋白在胃癌中表达的免疫组化结果与临床病理特征比较采用χ2检验，LVD在胃癌、癌旁组织组间以及在EphA2蛋白、VEGF-C蛋白高低表达组之间的差异性采用秩和检验，EphA2与VEGF-C蛋白的相关性检验采用Spearman等级相关分析，VEGF-C mRNA、EphA2 mRNA在癌、癌旁的比较采用秩和检验（经正态性检验，P＜0.05，不符合正态分布），相关性检验采用pearson相关分析。P＜0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 EphA2与VEGF-C蛋白在胃癌组织中的表达

EphA2和VEGF-C蛋白在胃癌组织中的阳性表达率分别为65.8%（54/82）和71.9%（59/82）（图1），而两者在癌旁组织中阳性表达率分别为42.6%、39%，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 EphA2和VEGF-C蛋白高表达与胃癌临床病理特征之间的关系

分析结果显示，EphA2与VEGF-C蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤的大小以及肿瘤分化程度无明显关系（均P＞0.05），但两种蛋白的表达与肿瘤浸润深度，有无淋巴结转移，TNM分期相关（均P＜0.05）（表1）。

图1 胃癌组织EphA2与VEGF-C免疫组化检测（×400） A：EphA2阳性表达；B：VEGF-C阳性表达；C：EphA2阴性表达；D：VEGF-C阴性表达Figure 1 Immunohistochemical staining for EphA2 and VEGF-C in gastric cancer tissues (×400) A: Positive EphA2 expression;B: Positive VEGF-C expression; C: Negative EphA2 expression; D: Negative VEGF-C expression

表1 EphA2与VEGF-C表达与胃癌临床病理特征的关系[n（%）]Table 1 Relations of EphA2 and VEGF-C expression with clinical factors of gastric cancer [n (%)]

2.3 EphA2和VEGF-C蛋白表达与LVD关系的分析

D2-40标记的淋巴管呈褐色染色（图2），EphA2和VEGF-C蛋白高表达组LVD计数分别为15.25±5.41、14.87±5.71，分别高于EphA2和V E G F-C蛋白低表达组（1 0.9 5±5.4 1、11.00±5.01）。秩和检验显示两者差异均有统计学意义（P=0.001、P=0.006）。

图2 D2-40免疫组化染色（×200） A：癌组织中（LVD计数14）；B：癌旁组织（LVD计数4）Figure 2 Immunohistochemical staining for D2-40 (×200) A: Gastric cancer tissue (LVD count of 14); B: Adjacent gastric tissue (LVD count of 4)

2.4 EphA2与VEGF-C蛋白表达的相关性

EphA2蛋白与VEGF-C蛋白同为高表达者47例，同为低表达者16例，EphA2蛋白低表达而VEGF-C蛋白高表达者12例，EphA2蛋白高表达而VEGF-C蛋白低表达者7例，经Sperman等级相关分析显示EphA2和VEGF-C蛋白表达呈正相关（r=0.375，P=0.001），（表2）。

表2 EphA2与VEGF-C蛋白表达的相关性Table 2 Correlation between EphA2 and VEGF-C protein expressions

2.5 20例胃癌患者中VEGF-C、EphA2 mRNA表达情况及其两者的相关性分析

20例胃癌癌组织EphA2 mRNA相对表达量为3.00±1.48，而癌旁组织为1.57±0.70，差异有统计学意义（P=0.002）；与EphA2 mRNA表达类似，20例胃癌患者癌组织VEGF-C mRNA相对表达量也明显高于癌旁组织[（3.33±1.76）vs.(1.86±0.94)，P=0.009]（表3）。采用Pearson相关分析结果显示EphA2 mRNA和VEGF-C mRNA表达量呈正相关（r=0.559，P=0.01） （图3）。

表3 EphA2、VEGF-C mRNA癌组织与癌旁组织中的相对表达量（±s，n=20）Table 3 Relative mRNA expression levels of EphA2 and VEGF-C in gastric cancer and adjacent tissues (±s,n=20)

表3 EphA2、VEGF-C mRNA癌组织与癌旁组织中的相对表达量（±s，n=20）Table 3 Relative mRNA expression levels of EphA2 and VEGF-C in gastric cancer and adjacent tissues (±s,n=20)

组织 EphA2 VEGF-C胃癌组织 3.00±1.48 3.33±1.76癌旁组织 1.57±0.70 1.86±0.94 P 0.002 0.008

图3 20例胃癌组织中EphA2与VEGF-C mRNA相关性散点图Figure 3 Scatter plot for correlation between EphA2 and VEGF-C mRNA expressions in 20 specimens of gastric cancer tissue

3 讨 论

胃癌是中国发病率和病死率都位居前三的肿瘤[6]。虽然近年来随着D2为主的规范手术的推广以及术后合理的化疗，胃癌患者的生存率有所提高，但相较于结直肠癌这类术后生存率较高的恶性肿瘤，其治疗效果仍不满意[7]。癌细胞的扩散和转移是导致癌症患者死亡的主要原因，且大多经血道和淋巴道转移，其中胃癌以淋巴道转移为主[8]。新生淋巴管的生成是肿瘤转移的必然条件，EphA2和VEGF-C是近年来恶性肿瘤淋巴道转移的热点研究分子。

E p h受体酪氨酸激酶通过与糖基磷脂酰肌醇（GPI）样或跨膜的ephrin配体结合调解细胞的黏附、迁移和血管生成[9]。作为Eph家族的重要成员，ephrin-A1/EphA2已被证实在胃癌、乳腺癌、Kaposi肉瘤、舌癌等多种肿瘤组织中明显过表达，并且EphA2高表达与胃癌患者肿瘤TNM分期、浸润深度、淋巴结是否转移以及预后密切相关，与本文结果一致[3]。而D2-40作为恶性肿瘤淋巴管转移的重要参考指标，本研究中由D2-40所得的LVD计数与EphA2的高表达存在相关性，更加进一步提示EphA2的表达与胃癌淋巴结转移存在正相关，故考虑EphA2可能通过某个途径促进胃癌淋巴结转移。

目前研究[10-11]表明ephrin-A1/EphA2复合体可通过参与E-cadherin、β-catenin、VEGF[12]、Ras和MAPK信号通路[13]、RAF/MEK/ERK[14]等信号通道调控肿瘤细胞之间黏附性，破坏细胞间连接以及诱导EMT（上皮细胞-间充质转化）发生，进而导致肿瘤侵润和转移。本研究中real time-PCR结果显示癌组织中EphA2 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，表明EphA2蛋白的高表达是受到转录水平调控。目前研究表明EphA2表达与乳腺癌[15]、非小细胞肺癌[16]、脑胶质瘤[4]等患者的预后相关。Yuan等[17]有研究提示高表达EphA2蛋白的胃癌患者预后较低表达者差，故可推测EphA2或可成为与预后有价值的判断指标。但是仅有EphA2单个指标，缺乏足够的特异性和敏感性，不足以评估胃癌患者的复发及转移风险。有必要进一步寻找特异性的促淋巴管生成因子及与EphA2的关系，为肿瘤淋巴转移提供特异性的检测指标。

VEGF-C是淋巴管生成特异性因子，能与位于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3结合，通过激活一系列反应，促进淋巴管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡，诱导毛细淋巴管的生成及发展，进而促进肿瘤内及肿瘤周围淋巴管生成，从而促使恶性肿瘤细胞进入淋巴系统发生远处转移，严重影响癌症患者的预后[18]。此外，实验中所见高表达VEGF-C蛋白的胃癌肿瘤组织中心区域较少看到开放性的淋巴管，但肿瘤边缘的组织中存在增生、扩张的淋巴管，与先前Saharinen等[19]研究结果基本一致，表明癌组织边缘新的淋巴管和毛细淋巴管形成对于恶性肿瘤的浸润、转移具有更加重要的意义和作用。RT-PCR结果表明胃癌组织VEGF-C的mRNA表达水平显著高于癌旁组织，进一步提示了胃癌与VEGF-C的mRNA表达相关。目前对VEGF-C参与肿瘤淋巴管生成机制的研究表明除肿瘤细胞本身能够分泌VEGF-C使癌组织中的VEGF-C水平升高外[20]，VEGF-C还可通过胰岛素样生长因子受体（IGFIR）[21]、纤连蛋白1（FN1）[22]等多种途径上调其表达。当VEGF-C结合并激活其受体VEGFR-3，随后VEGFR-3胞内区与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）形成复合物并活化PI3K和Akt，引起下游分子Erk1/2磷酸化，从而发挥调节淋巴管生成的作用[18]。有研究[23]提示高水平的VEGF-C不仅可以增加了肿瘤附近淋巴管的生成，也增强肿瘤细胞的迁徙运动功能。VEGF-C通过多种途径来促进肿瘤的侵润及转移，从而促进肿瘤进展，缩短患者的生存时间。但VEGF-C目前还有许多调节机制不清，需要进一步研究。

本研究中EphA2与VEGF-C两种蛋白的相关性分析结果显示两者无论在蛋白水平还是mRNA表达水平都存在正相关趋势，提示在胃癌细胞中EphA2与VEGF-C在蛋白和mRNA水平上可能共同协调新生淋巴管生成，从而导致肿瘤的侵润和转移。有研究[24]表明，EphA2可能通过PI3K/Akt信号通路调节VEGF-C表达。EphA2缺陷的小鼠中重新表达EphA2后，后者可通过激活下游信号分子PI3K恢复内皮细胞重塑脉管的能力。而肿瘤细胞中的EphA2可引起下游PI3K磷酸化和Akt的473位丝氨酸磷酸化，通过抑制肿瘤细胞的凋亡来促进肿瘤细胞的转移[25]，提示Akt是EphA2下游的重要分子。与此同时，细胞外基质蛋白Fibronectin的裂解体EDA可PI3K/Akt信号通路促进VEGF-C表达，而抑制PI3K/Akt信号通路后VEGF-C表达明显降低[5]，说明VEGF-C也是PI3K/Akt信号通路的靶分子之一。

值得肯定的是，在胃癌的浸润转移中，EphA2与VEGF-C相互介导，促进胃癌的淋巴转移。但是具体的介导通路机制，待进一步研究证实。

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