17味中药对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA表达水平与致色素作用的影响

姜丽莎，张晓东，张国斌，王恩波

17味中药对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA表达水平与致色素作用的影响

姜丽莎1，张晓东2，张国斌2，王恩波2

（1.章丘市人民医院 山东 济南 250200；2.解放军第202医院 辽宁 沈阳 110003）

目的：探讨17味中药对豚鼠皮肤中酪氨酸酶mRNA的调节与致色素作用。方法：以棕黄色豚鼠为实验模型，17味中药的75%乙醇提取液为实验组，8-甲氧补骨脂素（8-methoxypsoralan，8-MOP）为阳性对照组、75%乙醇为阴性对照组，均涂于豚鼠皮肤上，40d后取皮肤标本免疫组化染色，测平均灰度值与黑素细胞数目，比较其作用结果。结果：白芷、当归、甘草、枸杞、旱莲草、红花、女贞子、桑椹、沙参、沙苑子、首乌、菟丝子、黑芝麻、栀子等14味中药均可不同程度上调酪氨酸酶mRNA表达水平并促进黑素细胞增殖及黑素生成；合欢与益母草可促进黑素生成增加，但无明显上调酪氨酸酶mRNA表达水平的作用；黄芪则无明显上调酪氨酸酶mRNA表达水平、促进黑素细胞增殖及黑素生成的作用。结论：通过本研究表明部分中药可上调酪氨酸酶基因表达水平并促进黑素生成，为临床治疗白癜风优化组方提供实验依据。

中药；白癜风；酪氨酸酶mRNA；致色素；豚鼠

白癜风（Vitiligo）是一种原发性的、局限性或泛发性的皮肤黏膜色素脱失症。一般认为其发病是在多种内外因子的激发下，导致酶系统的抑制或黑素细胞的破坏或使黑素体的生成或黑化障碍，致使色素脱失[1]。黑素细胞是皮肤里的特殊细胞，可以产生黑色素，黑素小体是合成和储存和色素的亚细胞结构，黑素小体的生成或转运异常与白癜风等色素障碍性疾病的发病机理有密切联系[2]，酪氨酸酶在黑素小体的生成中起着重要的调控作用[3-5]。酪氨酸酶是黑素合成途径中的关键酶[6]，与酪氨酸酶mRNA的表达与调控有直接关系，酪氨酸酶活性的改变可引起白癜风等色素障碍性皮肤病[7]。

中医药治疗白癜风有悠久的历史，我们依据中医疏肝解郁、活血祛风辨证理论为法则组方，配制成红花复方制剂应用于临床，疗效尚佳[8]。现选取复方制剂中17味中药的乙醇提取液为制剂，以棕色豚鼠为动物模型，采用酪氨酸酶mRNA原位杂交方法，观察中药对豚鼠皮肤组织中酪氨酸酶基因表达水平的影响，同时用Fontana-Masson法染色观察中药的致色素作用，为治疗白癜风最佳组方提供可靠的实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：棕黄色豚鼠24只（辽宁长生生物技术有限公司），质量350g左右，雌雄各半兼用。

1.1.2 试剂：0.1%8-甲氧补骨脂素(8-MOP)-甲氧沙林（重庆华邦制药有限公司,国家准字号H50021839），酪氨酸酶mRNA原位杂交试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），DAB显色试剂盒（中衫生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器：中药粉碎机（ST-10B，永康市帅通工具有限公司），电子称（BS124S，德国赛多利斯集团），超声机（KQ-400DB，昆山市超声仪器有限公司），自动组织脱水机、烤片机、生物组织包埋冷冻机（天津天利航空机电有限公司），共览显微镜（DMD108），电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备：黄芪、当归、白芷、女贞子、枸杞、菟丝子、沙苑子、旱莲草、首乌、沙参、黑芝麻、黑桑葚、益母草、甘草、合欢皮、红花、栀子17味中药，80℃烘干粉碎，20目筛出并取粗粉10g,分别用75%乙醇100ml，室温密闭浸泡24h，超声提取2h，滤过，即得浓度为0.1g/ml的中药提取液,于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 实验分组：实验分中药实验组，8-MOP阳性对照组，75%乙醇阴性对照组。采用随机数字法将中药分成4组，Ⅰ组：女贞子、旱莲草、栀子、枸杞；Ⅱ组：甘草、首乌、黄芪、黑桑葚；Ⅲ组：白芷、当归、红花、合欢皮；Ⅳ组：黑芝麻、菟丝子、沙参、益母草、沙苑子。

取豚鼠24只，随机分4组，每组6只。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组各实验动物背部取6个3cm×3cm相隔离区域剪毛，Ⅳ组各实验动物背部取7个3cm×3cm相隔离区域剪毛，暴露皮肤，以便涂擦药物。外用中药提取液分别涂擦每个隔离脱毛区，四组豚鼠分别涂Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组中药，并每只均涂8-MOP与75%乙醇做阳性、阴性对照。涂豚鼠脱毛区，每次用0.5ml，2次/d，连续40d。在涂药时要反复擦，尽量使之渗透。各组涂药后1h，日光灯照射15min（功率40W×10，距离30cm）。每组豚鼠每3d脱毛一次。

1.2.3 取材：末次给药后1h，实验动物20%乌拉坦麻醉(0.5ml/100g)，用药部位中心取1cm×1cm皮肤。皮肤标本给予10%甲醛固定石蜡包埋。

1.3 结果测定及判定

1.3.1 酪氨酸酶mRNA原位杂交：测定酪氨酸酶mRNA水平按试剂盒说明操作。在高倍镜视野下观察各组的原位杂交切片和相应的背景对照切片，计数在高倍镜下每100个基底层细胞中胞浆呈棕黄色的细胞数并拍照。每张切片随机选择10个视野，应用Image-Pro Plus 6.0软件处理系统测定其灰度值。

1.3.2 黑素颗粒染色：Fontana-Masson染色步骤：切片脱蜡水化，将切片置入Fontana硝酸银溶液，37℃孵箱中2h，蒸馏水洗3次，VG液对比染色2min后，蒸馏水冲洗、脱水，封片观察色素分布情况。随机选择6个高倍视野（×400），共36个视野，测量每视野下基底层和基底上层中周围环绕色素的细胞比（定义为阳性细胞），阳性细胞≤5%为阴性，记为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，≥50%为3分，≥75%为4分。

1.4 统计学方法：实验数据用（x¯±s）表示，应用SPSS17.0软件处理系统进行数据的统计，计量资料采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酪氨酸酶mRNA阳性细胞主要分布于表皮基底层、棘层、颗粒层,少数阳性细胞分布在真皮浅层,中药组较乙醇对照组明显增多,与8-MOP组无明显差异（图1～3）；正常豚鼠皮肤黑色素分布于基底层、棘层和颗粒层，呈黑色颗粒状，中药组表皮基底层中黑素颗粒连续，几乎布满表皮全层，较乙醇对照组明显增多,与8-MOP组无明显差异（图4～6）。

2.2 17味中药对酪氨酸酶mRNA的影响（见表1）。

2.2.1 促进酪氨酸酶mRNA杂交细胞数目及灰度值上升：白芷、当归、甘草、枸杞、旱莲草、红花、女贞子、桑椹、沙参、沙苑子、首乌、菟丝子、黑芝麻、栀子与75%乙醇对照组比较，差异显著，P＜0.05。

2.2.2 对酪氨酸酶mRNA杂交细胞数目及灰度值无影响：合欢、黄芪、益母草与75%乙醇对照组比较，无显著差异，P＞0.05。

2.3 17味中药对色素影响（见表1）。

2.3.1 促进黑色素增多：白芷、当归、甘草、枸杞、旱莲草、合欢、红花、女贞子、桑椹、沙参、沙苑子、首乌、菟丝子、益母草、黑芝麻、栀子与75%乙醇对照组比较，差异显著，P＜0.05。

2.3.2 对黑色素无影响：黄芪与75%乙醇对照组比较，无显著差异，P＞0.05。

表1 17味中药对酪氨酸酶mRNA在豚鼠皮肤中的表达及致色素作用（x¯±s）

图1 乙醇组豚鼠皮肤酪氨酸酶表达（免疫组化染色×400）

图2 8-MOP组豚鼠皮肤酪氨酸酶表达（免疫组化染色×400）

图3 中药（黑芝麻）组豚鼠皮肤酪氨酸酶表达（免疫组化染色×400）

图4 乙醇组豚鼠皮肤黑素颗粒表达（Fontana-Masson染色×400）

图5 8-MOP组豚鼠皮肤黑素颗粒表达（Fontana-Masson染色×400）

图6 中药（黑芝麻）组豚鼠皮肤黑素颗粒表达（Fontana-Masson染色×400）

3 讨论

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，皮损处黑素的生成明显减少或消失。酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，决定黑素合成的速率，其活性与黑素合成量相关[9]。它的表达与其mRNA表达与调控有直接的关系，酪氨酸酶活性的改变可引起白癜风等色素障碍性皮肤病[10-11]。

中药治疗白癜风的疗效是肯定的[12]，但是中药的作用机制有待进一步研究。李洪武等[13-14]研究表明中药赤芍、菟丝子可在转录水平上调酪氨酸酶基因表达水平，诱导皮肤黑素生成，证明部分中药对治疗白癜风有重要意义。本实验为了探讨中药治疗白癜风的作用机理，选用棕色豚鼠作为动物模型，采用原位杂交方法检测了17味中药对酪氨酸酶mRNA基因表达的影响，同时应用Fontana-Masson染色观察其对豚鼠皮肤致色素作用，实验结果显示：①白芷、当归、甘草、枸杞、旱莲草、红花、女贞子、桑椹、沙参、沙苑子、首乌、菟丝子、黑芝麻、栀子等14味中药均可不同程度地上调酪氨酸酶mRNA表达水平并促进黑素细胞的增殖及黑素生成；②合欢、益母草有促进黑素生成增加的作用，但无明显上调酪氨酸酶mRNA的表达水平；③黄芪无明显上调酪氨酸酶mRNA表达水平、促进黑素细胞的增殖及黑素生成的作用。本实验中17味中药促进酪氨酸酶mRNA表达水平、黑素细胞的增殖及黑素的生成作用不完全平行，提示中药促进黑素生成不限于激活酪氨酸酶，可能还与转录水平后其他促黑素细胞增殖因素有关，黑素合成的可在黑素合成相关酶类基因的转录和活化、黑素小体的合成及转运、黑素的分布与降解等不同的途径上进行[15]，中药的作用机制尚待进一步研究。本研究通过检测中药对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA水平的表达和致色素作用的影响，有助于说明中药在转录水平治疗白癜风等色素脱失性疾病的机理，为临床用药提供参考资料，并为开发治疗白癜风等色素脱失性疾病的药物提供线索，部分中药在治疗白癜风的其他机制有待进一步研究。

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Effects of Ethanol Extracts from 17 Traditional Chinese Medicine (TCM) on the mRNA Level of Guinea Pig’s Tyrosinase and Melanogenesis

JIANG Li-sha1,ZHANG Xiao-dong2, ZHANG Guo-bin2, WANG En-bo2
(1.Zhangqiu People's Hospital,Jinan 250200,Shandong,China; 2.The 202 Military Medical University of Chinese PLA,Shenyang 110003,Liaoning,China)

ObjectiveTo explore the effects of 17 traditional Chinese medicine (TCM) on the expression of Tyrosinase mRNA gene and melanogenesis from skin of guinea pigs.MethodsThe brown guinea pigs used as the experimental model,ethanol extracts obtained from 17TCM as the experimental group,8- Methoxypsoralen (8-MOP) as positive control group,75% ethanol as the negative control group,coated on the skin of guinea pigs,40 days later cut of sample skin and process it with immunohistochemical staining,measured the mean gray value and the number of melanocytes, and compared the results.ResultsThe 14 kinds of TCM such as Angelica dahurica,Angelica sinensis, Licorice,Chinese wolfberry, Eclipta, Safflower,Privet fruit,Mulberry,Adenophora stricta,Astragalus complanatus, Polygonum multiflorum, Dodder,Black sesame,Gardenia could upregulate the gene expression of tyrosinase mRNA and enhance the melanogenesis and promote the proliferation of melanocytes in different degrees.Acacia and Motherwort could promote melanogenesis increased,but no significant effect on tyrosinase mRNA expression;There is no effect of Astragalus.ConclusionThis study showed that some TCM can increase tyrosinase gene expression and promote melanogenesis,which provide scientific basis for optimal prescriptions in the treatment of vitiligo.

Traditional Chinese Medicine (TCM); Vitiligo; Tyrosinase mRNA; Cause pigment; Guinea pigs

Q591.3 R758.4+1

A

1008-6455（2017）02-0073-03

2016-10-23

2017-01-26

编辑/张惠娟

辽宁省自然科学基金（201102231）

张晓东，主任医师，中药治疗白癜风的机制研究，沈阳202医院皮肤科，110000；E-mail:zhangxiaodong_202@163.com