不同培养基对皮肤来源的成纤维细胞增殖、衰老及胶原蛋白分泌的影响

喇文军，林孝发，蒋 伟，王 妍，尹卫民，林嘉欢，林 峰

不同培养基对皮肤来源的成纤维细胞增殖、衰老及胶原蛋白分泌的影响

喇文军1，林孝发1，蒋 伟1，王 妍1，尹卫民2，林嘉欢1，林 峰1

（1.深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院 广东 深圳 518055；2．深圳市君焯医疗美容整形研究所广东 深圳 518040）

目的：探讨不同培养基组成对皮肤成纤维细胞的增殖、衰老及胶原蛋白分泌的影响。方法：采用两步酶消化法从健康人耳后皮肤中获得成纤维细胞，依据培养基种类不同分为A组（FM无血清培养基）、B组（DMEM+10%FBS）、C组（RPMI-1640+10%FBS）、D组（DMEM+F12(1∶1)+10%FBS），采用MTT法、细胞划痕实验、酶联免疫吸附实验、β-半乳糖苷酶试验、软琼脂克隆形成试验比较不同培养基对细胞增殖、迁移、胶原分泌、老化、变异的影响。结果：采用酶消化法在2d～4d内即可从组织块中获得大量成纤维细胞；其中B、D组较A、C组细胞增殖较快，且趋势与MTT细胞增殖相同；划痕实验显示B、D组较A、C组向缺损部位迁移更为明显；此外，D组胶原蛋白分泌量高于其余三组（P＜0.05），且连续传代30次后，细胞无明显衰老及瘤变迹象。结论：两步酶消化法可快速高效的从人组织块中获得成纤维细胞，且采用DMEM+F12(1∶1)完全培养基有利于促进细胞增殖、分泌胶原蛋白及延缓细胞衰老。

成纤维细胞；培养基；胶原蛋白；细胞增殖；原代培养

医疗技术的发展及人们生活水平的提高，使人类平均寿命得到有效延长的同时，也使延缓衰老渐渐进入人类视野。而皮肤作为人体最大的器官，其结构完整、美观不仅影响着心情，也体现其生活质量的高低。因此，越来越多的爱美人士渴望通过医疗技术干预皮肤老化。然而，目前市场主流的抗衰老产品多以化学药物或激光疗法为主，其短期效果明显，但长期效果及安全性却一直备受质疑[1-2]。自体细胞回输技术，其采用体外培养自体成纤维细胞达一定数目及活性后，将其回输入人体执行特定皮肤部位老化细胞的功能，从而对延缓皮肤衰老起到促进作用，具有更高的安全性及有效性[3]。然而，如何快速获得活性细胞在一定程度上制约了自体细胞回输技术的临床应用。因此，本研究对耳后皮肤中成纤维细胞进行提取，传代，通过研究不同培养基对成细胞细胞增殖、胶原分泌以及细胞传代中的稳定性进行分析，以期为该技术的推广应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料：①正常耳后皮肤组织由深圳市君焯医疗美容整形研究所提供；A549肺癌细胞由深圳市大规模细胞培养技术和细胞资源库公共技术服务平台提供；②0.25%胰酶，II型胶原酶、人胶原酶I型酶联免疫分析试剂盒购自sigma公司；MTT试剂盒、β-半乳糖苷酶购自碧云天公司；FM无血清培养基购自sciencell公司；Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基、Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培养基、Nutrient Mixture F-12（F12）培养基、胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分组：A组FM无血清培养基，B组DMEM+10%FBS，C组RPMI-1640+10%FBS, D组DMEM+F12(1:1)+10%FBS；

1.2.2 成纤维细胞原代培养：无菌条件下取正常耳后皮肤约2cm×3cm，将其放入无菌PBS中迅速带回实验室，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5∶1加入消化液I（0.25%胰酶+0.02EDTA）,4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10∶1加入消化液2（1mg/ml II型胶原酶），37℃，2h处理。将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，并将其等分成4份进行离心 500r/min，10min，补加相应培养基重悬后，加到T25细胞培养瓶中，37℃ 5%CO2过夜培养，并镜下观察细胞是否呈现放射状或漩涡状生长。

1.2.3 细胞增殖实验：单层成纤维细胞经消化液1消化后，依据分组情况，加入相应培养基稀释细胞密度至约5×103个/ml，以100μl/孔接种于6块96孔板中，每组12个孔，且96孔板外围不设实验孔。随后将6块96孔板放入37℃ 5%CO2培养箱中培养，并在12h、24h、48h、72h、96h、120h时间点取一块96孔板弃去培养液，加入MTT（50μl/孔），37℃、5%CO2培养4h，缓慢吸取培养液并用清水沿孔壁吸取未反应的MTT，滤纸拍干，随后加入DMSO（150μl/孔），室温振荡10min，在波长490nm下读取各孔吸光度值，并计算各组吸光度平均值。

1.2.4 细胞划痕实验：将四种培养基培养的成纤维细胞，按2×105cell/孔，接种至6孔板中，37℃、5%CO2培养过夜至细胞铺满六孔板，采用无菌枪头在六孔板底部人为划出几道横，PBS清洗3次后，加入相应培养基，每隔2h在同一部位拍照观察细胞迁徙情况。

1.2.5 胶原酶分泌：将各组细胞转移至T25细胞培养瓶中培养，每次传代前，吸取细胞上清液-20℃冻存，PBS清洗一次，加入消化酶1消化3min，离心，取出消化酶1,加入培养基重悬，吸取一半补加入原瓶37℃、5%CO2继续培养，共收集各组在传代前、传代1次、传代2次、传代3次、传代4次上清液，离心3 000r/min,10min，将样品存于-20℃冰箱备用，并按照试剂盒说明书进行人胶原蛋白酶I酶联免疫试验。

1.2.6 细胞衰老：采用β-半乳糖苷酶检测试剂盒，大致步骤如下：将细胞传代按5×104cell/孔接种至6孔板中，PBS清洗，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温放置15min，吸弃固定液，PBS清洗3次，3min/次，加入1ml染色液放置于不含CO237℃培养箱中孵育过夜，隔日显微镜下观察细胞染色情况。

1.2.7 软琼脂克隆形成实验：配置2X DMEM-F12完全培养基（含2X FBS），并与等体积1.2%低熔点琼脂混合加入6孔板中，每孔1.6ml，常温放置待其凝固。将传代30次的成纤维细胞经胰酶消化、离心，添加2X完全培养基稀释细胞浓度至1×105cell/ml；另将2X DMEM-F12完全培养基与等体积0.7%低熔点琼脂糖混合后，并加入100μl细胞悬液混匀，添加至含有下层凝固的琼脂完全培养基中，放入37℃、5%CO2培养箱10d～14d后，每孔加入1ml(0.01%)结晶紫，室温染色10min，拍照计数。其中，本实验以A549肺癌细胞作为阳性对照。

1.3 统计学分析：采用SPSS19.0统计分析软件，对其中计量资料以（x¯±s）表示，并进行重复资料方差分析或成组t检验。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞原代培养：皮肤组织经消化液1及消化液2处理后，各组均在37℃，5%CO2培养条件下培养。其中B、D组在培养72h后均可见大量成纤维细胞及少量上皮样细胞（见图1A），依据两种细胞对消化酶I耐受度不同，通过3次传代后，视野下即无上皮样细胞（见图1B）。而A、C组则需培养96h以上才可达到细胞融合度80%以上并进行传代。

2.2 MTT实验结果：其结果显示，培养24h后，四组细胞均开始增殖。其中B组、D组细胞在培养48～72h细胞增殖最快，而A、C组在72～96h增殖快。经统计分析，四组在培养72h后，OD值差异存在统计学意义（F=14.353,P=0.034）（见图2）。

2.3 细胞划痕实验：自细胞划痕后24h内，每隔2h对细胞迁徙情况进行拍照，其结果显示，当采用D组培养液细胞迁移速度明显快于其余各组。见图3。

2.4 胶原蛋白检测：各组均先扣除传代前胶原蛋白含量，其中A组细胞分泌胶原含量相对稳定，而B、D组在传代3次后胶原分泌达到最大后胶原分泌量逐渐减少，见表1。

图1 细胞原代培养结果

图2 各组细胞MTT实验结果

表1 各组细胞胶原蛋白分泌检测 （x¯±s）

2.5 β-半乳糖苷酶：自细胞传代至38代时，对四组细胞分别进行β-半乳糖苷酶检测，其中B组细胞衰老明显，而C组次之，A、B组较不明显。见图4。

2.6 软琼脂克隆形成实验：以A549肺癌细胞为阳性对照品，其结果显示，皮肤成纤维细胞在体外培养30代后，接种在软琼脂上培养15d后，不形成克隆且细胞均死亡，见图5。

3 讨论

衰老是人类生命历程中不可缺少的环节，且往往从一个细胞群的老化为起点。而成纤维细胞作为是皮肤中重要的细胞之一，其不仅能合成及分泌胶原蛋白来维持皮肤弹性及韧性，同时也可在皮肤受到损伤时，参与组织修复。而目前研究证实，成纤维细胞活性减弱，胶原蛋白分泌量减少是皱纹产生的重要因素[4]。目前抗皱化妆品种多含有人表皮神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等，这类生长因子也主要作用于成纤维细胞[5]。此外，针对皮肤性疾病或烧伤等意外引起的皮肤缺损，单靠自体皮肤移植已不能满足临床应用需求，若能在短时间内，通过体外培育出大量的人表皮成纤维细胞或将为临床应用提供新的思路。由此可见，表皮成纤维细胞的培养具有极高的临床应用价值。

图3 细胞迁移实验

图4 各组细胞衰老实验

图5 软琼脂克隆形成实验

针对以往研究中多采用包皮组织作为实验用皮肤，虽其具有取材方便的优点，但皮肤来源均为男性，在实际应用中并不能广泛代表所有人群皮样特点。而鉴于大多数人群的耳后皮肤在实际生活中均较少受到摩擦，皮肤细胞更替慢，其个体间差异较小，从而能更具有广泛性结果。因此，本研究特以人耳后皮肤作为实验用组织。另外，本研究采用酶消化法替代植块法。对于0.5cm×0.5cm皮肤块，经酶消化后24h即可见成纤维细胞贴壁，消化后72～96h可见大量成纤维细胞贴壁，不仅保证的细胞数目及细胞正常形态，同时减少细胞增殖次数，缩短实验周期。而朱静、丛敬[6-7]等采用植块法，不仅操作步骤繁琐如及时翻转细胞培养瓶等，且细胞需培养14d以上才可顺利进行传代，且远离组织块处细胞已明显变大、老化，使得获得细胞质量及数量均不如酶消化法。陈甫寰、赵洪良[8-9]等采用酶消化法处理人皮肤组织，其获得的目的细胞时间大大缩短。此外，针对酶消化法中的残留的表皮细胞，根据文献报道[10]，表皮细胞较成纤维细胞更加耐受胰酶，但贴壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替换培养液的方法可获得高纯度的成纤维细胞。

虽然采用酶消化法可在短时间内获得大量成纤维细胞，但成纤维细胞是否也有自身偏爱的营养成分？我们发现，采用DMEM+F12培养基可有效促进细胞的增殖，采用RPMI-1640培养基时，细胞增殖速度相对缓慢，而MTT实验进一步证实了，即使是相同细胞密度下，DMEM及DMEM+F12对于细胞的促增殖作用也明显高于RPMI-1640及FM无血清培养基。如以往文献报道[11]，贴壁类细胞采用DMEM培养时可获得较快生长速度，其高浓度的细胞增殖成分使得刚分离的成纤维细胞可快速适应体外培养环境。此外，考虑临床应用细胞的部位多为受损或老化部位，因此本文通过人为创造创面，来模拟细胞在注射入人体内后的迁移情况。其结果显示，成纤维细胞填充创面速度为：DMEM+F12≥DMEM＞FM＞RPMI-1640。但对细胞形态进行观察发现，DMEM细胞形态变大，而DMEM+F12仍保持原有细胞形态。由于细胞衰老时多出现细胞核增大现象，以便利于细胞吸收更多物质。而衰老细胞在分泌胶原蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白等细胞外基质能力明显减弱，而这类物质不仅对细胞起到支撑、连接作用，同时也是细胞间信号传导的重要桥梁[12-13]。因此，在保证细胞增殖速度的同时，更要防治细胞过早衰老。虽然DMEM细胞营养成分浓度较高，但其营养成分种类较少，而F12培养基似乎可以弥补DMEM在此方面的缺陷，从而在促进细胞增殖过程中，避免了细胞过度老化[15]。而从β-半乳糖苷酶结果也验证了以上猜测，对以上四组细胞进行相同次数传代至38代可知，DMEM培养下的细胞衰老速度明显快于其余三组细胞，而其余三组未见明显差异。

另外，细胞自体回输，除了要保证细胞数量，其质量及安全性也至关重要。其中胶原蛋白分泌量是检验成纤维细胞活性的最佳标准之一[15]。而对四组细胞培养液中胶原蛋白进行ELISA结果显示，FM无血清培养基可使细胞稳定表达胶原蛋白，而DMEM+F12则有利于提高细胞前期胶原蛋白表达。另外，我们对培养30代的D组成纤维细胞进行软琼脂克隆形成实验，其结果证实，在体外培养30代情况下，细胞暂时可保持正常生长状态，无明显肿瘤化生长迹象。

综上所述，采取酶消化法有助于快速从人皮肤组织中获得成纤维细胞，而采用DMEM+F12培养基有助于成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌。

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The Effects of Different Culture Medium on the Proliferation, Aging and Collagen Secretion of Fibroblasts From Skin

LA Wen-jun1,LIN Xiao-fa1,JIANG Wei1,WANG Yan1,YIN Wei-min2,LIN Jia-huan1,LIN Feng1
(1.School of Applied Chemistry and Biotechnology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055, Guangdong,China; 2.Institute for Jun Zhuo Medical Cosmetology and Plastic Surgery of Shenzhen,Shenzhen 518040,Guangdong,China)

Objective To investigate the effects of different culture medium on the proliferation, aging and collagen secretion of fibroblasts.MethodsFibroblasts were obtained from healthy human ear skin after using two-step enzyme digestion method. According to different kinds of culture medium, they were divided into A group (serum-free medium), B group (DMEM+10%FBS), C group (RPMI-1640+10%FBS), and D group (DMEM+F12 (1∶1) +10%FBS), MTT assay,cell scratch assay,enzyme-linked immunosorbent assay,beta galactosidase assay,and soft agar colony formation test were used to compare the effects of different medium on cell proliferation,migration, collagen secretion,aging and mutation.ResultsA large number of fibroblasts were obtained from the tissue by enzyme digestion within 2d-4d; group B and group D proliferated more rapidly than group A and group C, which was the same as MTT cells proliferation;the result of scratch test showed that group B and group D migrated to the defect site more obviously than group A and group C; in addition, the collagen secretion of group D was the highest in all the four groups (P＜0.05),and after 30 passages,cells had no obvious signs of aging and neoplasia.ConclusionUsing two-step enzyme digestion method can obtain fibroblasts from human tissue quickly and efficiently, and the use of DMEM+F12 (1∶1) complete culture medium is beneficial to promote cell proliferation and collagen secretion and to delay cell aging.

fibroblasts; culture medium; collagen; cell proliferation; primary culture

Q813.1

A

1008-6455（2017）02-0068-05

2016-10-18

2016-12-25

编辑/张惠娟

深圳市科技创新委（GGJS20130331152344401）

林峰，男，教授，研究方向为精细化工；E-mail：linf2000@szpt.edu.cn