不同强度急性有氧运动对肥胖小鼠PGC-1α及其下游因子的调控影响

朱小烽，王茹，杨钦，马云，田倩倩，杨亚兵

不同强度急性有氧运动对肥胖小鼠PGC-1α及其下游因子的调控影响

朱小烽1，王茹2，杨钦2，马云3，田倩倩2，杨亚兵2

目的：通过高脂膳食诱导肥胖小鼠模型，观察不同强度急性运动对肥胖小鼠PGC-1α及其下游因子的转录与翻译水平的影响，进一步探讨PGC-1α信号在运动减控体重中的生理机制。方法：C57BL/6J雄性小鼠经高脂膳食诱导建模成功后，随机分为安静对照组（C组）、小强度（SE组）、中强度（ME组）、大强度有氧运动组（HE组）。后3组进行不同强度的一次性跑台训练，运动后即刻处死。采用ELISA测定血清TNF-α、IRISIN、MCAD、CPT-1含量；实时荧光定量PCR测定骨骼肌PGC-1α、PPARγ、PPARβ、TNF-α及FNDC5 mRNA相对表达量。结果：与C组比较，SE组小鼠血清MCAD显著性提升（P＜0.05）；ME和HE组TNF-α显著性下降（P＜0.05；P＜0.01）；CPT-1与Irisin4组间差异不具有显著性（P＞0.05）；与C组相比，SE、ME及HE组骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量显著性提升（P＜0.01）；ME与HE组PPARγ mRNA显著性增加（P＜0.05；P＜0.01）；ME与HE组PPARβ mRNA显著性增加（P＜0.01；P＜0.05）；3个运动组中TNF-α mRNA相对表达量显著性降低（P＜0.01）；ME与HE组FNDC5 mRNA相对表达量显著性增加（P＜0.05）。骨骼肌PGC-1α mRNA与FNDC5 mRNA相对表达量呈显著性正相关（P＜0.01）；骨骼肌FNDC5 mRNA相对表达量与血清Irisin含量相关性较低（P＞0.05）；骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量与血清TNF-α含量显著性正相关（P＜0.05）。结论：急性有氧运动可以显著增强PGC-1α及其下游因子的转录与翻译水平；小鼠骨骼肌氧化代谢和炎症反应之间可能存在相互拮抗的肌肉分子机制。

有氧运动；糖尿病；PGC-1α；Irisin；TNF-α；FNDC5

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1α）是与机体能量代谢关系较为密切的转录辅助激活因子，在机体产热、线粒体合成、糖脂代谢和骨骼肌纤维类型转换等过程中发挥着重要作用［8，18，22］。PGC-1α主要表达于富含线粒体的组织中，如棕色脂肪、肝脏、骨骼肌等。近些年PGC-1α已成为糖尿病、肥胖等代谢性疾病治疗的研究新靶点［3，6，29］。运动促使PGC-1α表达增加可能是骨骼肌适应性调节的一种表现［6，8］。已有研究表明［19，24］，不仅是长期运动可以增加PGC-1α表达，急性运动同样可以增加。PGC-1α在鼠类动物模型中的超表达，可造成肌纤维类型的转换，增强脂肪酸的氧化能力以及线粒体生物合成和血管再生过程。

中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）和肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）是调控机体氧化代谢和脂肪酸合成的关键酶，也是调控长链脂肪酸进入线粒体进行β氧化的重要酶［5］。过氧化物酶体增殖剂激活受体（Peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）是核激素受体家族中的配体激活受体，在不同的物种中已经发现了3种亚型，参与糖脂代谢、脂肪细胞分化和骨骼肌重塑等重要生理调控过程，属于配体诱导核受体。MCAD和CPT-1的表达可被PGC-1α调控，PPARγ也可被PGC-1α辅助激活［27，30］，它们都属于PGC-1α调控的下游因子。

目前，长期有氧运动提升高脂膳食小鼠骨骼肌中的PGC-1α，继而促进脂肪酸的有氧氧化已被众多研究所证实［19，30］，但是急性运动对PGC-1α及其下游因子的表达调控尚不清楚。本实验通过高脂膳食诱导小鼠肥胖模型，并进行一次性有氧运动干预，观察不同运动强度和运动方式对肥胖小鼠PGC-1α及其下游因子的转录与翻译水平的影响，进一步探讨PGC-1α及其下游信号在运动减控体重中的生理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

6周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠，购自第二军医大学实验动物中心。随机分成普通饮食组（喂食普通饲料）和高脂诱导组（喂食D12492高脂饲料，其中脂肪提供热量占总热量的60%）。每周记录小鼠体重，10周诱导后选取体重达标的小鼠进行下一步实验（肥胖标准［12］：高脂诱导肥胖组体重＞120%对照组平均体重），造模成功后普通饮食组体重25.77±1.32g，高脂诱导肥胖组体重32.45±1.06g。在肥胖组中随机抽取35只为实验组。其中安静对照组10只（C组），小强度有氧运动组8只（SE组），中等强度有氧运动组8只（ME组）、大强度有氧运动组（HE组）9只。

实验动物的处死方法符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。各组小鼠处死取材，计算体脂率［体脂率=（左右肾周脂肪+左右附睾脂肪）/体重×100%］，见表1。

1.1.2 运动方案设计

SE组：跑台坡度为0，以5 m/min的速度开始运动5 min，后以8 m/min的速度运动55 min，总运动时间60 min；ME组：跑台坡度为0，以5 m/min的速度开始运动5 min，后以8 m/min的速度运动5 min，最后12 m/min，运动50 min，总运动时间60 min；HE组：跑台坡度为0，以5 m/min的速度开始运动5 min，后以8 m/min的速度运动5 min，最后18 m/min，运动50 min，总运动时间60 min。C组：不运动。所有运动组正式开始前，进行3天的适应性训练，跑台坡度为0°，速度为5 m/min，10 min/d。

1.1.3 取材

所有小鼠运动后即刻腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。采用摘除眼球方法采血，后断颈处死，迅速取出肾周脂肪、附睾脂肪、后肢腓肠肌等组织置于液氮中速冻，后转入－80℃超低温冰箱保存备用。血液样本经4 000 rpm离心后分离血清，置－80℃冰箱保存。

1.1.4 主要仪器设备与试剂

实时荧光定量PCR仪（ABI StepOne Plus，Applied Biosystems公司）、微孔板分光光度仪（Biotek）。

TNF-α、IRISIN、MCAD、CPT-1酶联免疫监测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。提取组织RNA及PCR相关试剂：Trizo（lLot：117206，Invitrogen公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Ki（tCatalog：K1622，Thermo Scientific公司）；FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（Lot：16385700，Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 血清TNF-α、IRISIN、MCAD、CPT-1测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验进行测定（ABC-ELISA）。测定时严格按照说明书的步骤执行。

1.2.2 骨骼肌组织PGC-1α及其下游基因mRNA测定

采用Trizol提取骨骼肌总RNA。测量总RNA的浓度，经逆转录反应后合成cDNA，实时荧光定量PCR法测定PPARγ、PPARβ、PGC-1α、TNF-α及FNDC5 mRNA表达量。qRT-PCR扩增反应条件设定为：50℃2 min×1 cycle；95℃10 min×1 cycle；95℃15 s×40 cycles。以GAPDH为内参，RQmin、Rqmax及Ct值由软件自动分析得出，采用2-△△Ct进行相关定量。利用PUBMED主页的Primer-BLAST功能设计相关引物，委托上海生工生物技术公司合成引物序列，各基因上下游引物序列见表2。

1.2.3 统计方法

实验数据用SPSS 19.0软件数据包处理，各数据用平均数±标准差（±SD）表示。多组间比较采用One-way ANOVA中的两两比较（LSD检验），相关性分析采用双变量相关性分析，以P＜0.05和P＜0.01定为差异显著性水平的界值。最后利用GraphPad Prism 5软件进行数据处理及图像生成。

表2 基因上下游引物序列Table 2Gene Upstream and Downstream Primer Sequences

2 研究结果

2.1 不同强度急性运动对小鼠血清TNF-α、IRISIN、MCAD、CPT-1浓度的影响

由表3可以看出，与C组比较，SE组小鼠血清MCAD显著性提升（P＜0.05），ME、HE组与C组差异不具有显著性（P＞0.05）；CPT-1 4组间差异不具有显著性（P＞0.05）；与C组相比，ME组小鼠血清TNF-α显著性下降（P＜0.05），HE组差异具有显著性（P＜0.01），SE组无显著性差异（P＞0.05）；Irisin 4组间差异不具有显著性（P＞0.05）。

2.2 不同强度急性运动对小鼠骨骼肌PGC-1α及其下游基因mRNA表达的影响

由图1可以看出，与C组相比，SE、ME及HE组小鼠急性运动后骨骼肌PGC-1αmRNA相对表达量显著性提升（P＜0.01）；与C组相比，ME与HE组PPARγ mRNA显著性增加（P＜0.05；P＜0.01），SE组差异不显著（P＞0.05）；与C组相比，ME与HE组PPARβ mRNA显著性增加（P＜0.01；P＜0.05），SE组不显著（P＞0.05）；与C组相比，其他3组急性运动后TNF-α mRNA均显著性降低（P＜0.01）；与C组相比，ME与HE组FNDC5 mRNA均显著性增加（P＜0.05），SE组不显著（P＞0.05）。

表3 不同运动组小鼠血清Irisin、MCAD、CPT-1、TNF-α的水平变化Table 3Changes in Serum Irisin、MCAD、CPT-1、TNF-α Levels of Different Groups

图1 急性运动后小鼠骨骼肌基因mRNA相对表达量A：PGC-1α mRNA B：PPAR γ mRNA C：PPAR β mRNA D：TNF-α mRNA E：FNDC5 mRNAFigure 1.Relative Expression of mRNA Gene in Skeletal Muscle of Mice after Acute Exercise

2.3 FNDC5、PGC-1α、Irisin及TNF-α相关性分析

图2A显示，骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量与FNDC5 mRNA相对表达量显著性正相关（P=0.000）；图2B显示，骨骼肌FNDC5 mRNA相对表达量与血清Irisin含量相关性较低（P=0.496）；图2C显示，骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量与血清TNF-α含量显著性正相关（P=0.043）。

3 分析与讨论

静态生活方式是许多慢性疾病的独立风险因素。在多数情况下，体力活动不足是与全身系统或者局部器官慢性炎症反应联系在一起的。相反，锻炼能有效地预防和治疗多种疾病。运动对于健康促进的良性效果的分子机制还有很多未能充分理解（尽管体力活动对预防和治疗这些慢性疾病已经得到大量的研究证实，但是我们对适宜性锻炼引起骨骼肌分子机制领域的了解还尚不清晰）［14，15，18］。

PGC-1α是与机体能量代谢关系较为密切的转录辅助激活因子，被认定为核受体转录因子PPARγ的耦合子（交互子）［13］。国内Zhang Y等研究者认为，PGC-1α通过激活PPAR进而激活FXR（famesoid X受体）基因转录，最终促进脂肪代谢，这些研究证明，PGC-1α及其下游因子在机体脂肪酸氧化代谢过程中起着关键的作用［32］。许多动物研究表明［22，24］，长期和急性运动均可以增加肥胖小鼠PGC-1α表达。我们的实验也同样证实了这一现象，与C组相比，其他3个运动组中骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量都显著增加（P＜0.01）。

图2 FNDC5、PGC-1α、Irisin及TNF-α相关性A：PGC-1αmRNA与FNDC5 mRNA相关性（n=32，P=0.000）；B：FNDC5 mRNA与血清Irisin相关性（n=32，P=0.496）；C：PGC-1αm RNA与血清TNF-α相关性（n=32，P=0.043）Figure 2.Correlation between FNDC5，PGC-1α，Irisin&TNF-αA:Correlation Between PGC-1αmRNA and FNDC5 mRNA（n=32，P=0.000）B:Correlation Between FNDC5 mRNA and Serum Irisin（n=32，P= 0.496）C:Correlation Between PGC-1αm RNA and Serum TNF-α（n=32，P=0.043）

PPARβ和PPARγ作为糖脂代谢的重要核受体，不仅在机体肥胖和致炎过程中发挥着重要的作用，而且PPARβ对提高机体耐力水平和促进肌纤维类型的转化过程中亦作用明显，较多研究发现，运动可以诱导PGC-1α的高表达，进而激活PPAR。本研究中，PPARβ与PPARγ在中等强度运动组与大强度运动组后都有显著性增加，但是在小强度运动后没有显著性变化，运动强度可能是导致这一现象的关键因素。

CPT-1和MCAD是调控机体氧化代谢和脂肪酸合成的关键酶，也是调控长链脂肪酸进入线粒体进行β氧化的重要酶［5］。近些年，针对肥胖动物的研究显示［4］，高浓度的长链脂肪酸借助PPAR在转录水平上激活CPT-1的表达，增强了机体的氧化代谢能力，有效地降低了高脂饮食引起的脂质紊乱发生的可能，最终改善血脂状况。在本研究中，与安静对照组相比，急性低强度运动组的MCAD水平显著上升（P＜0.05），但其余两组运动组则无显著性差异，同时4组CPT-1指标也无显著性差异。这是否与肥胖模型的建立方法及运动强度具有关联？还需进一步研究证实。

PGC-1α在骨骼肌中可促进Ⅲ型纤连蛋白结构域5（FibronectintypeⅢdomain-containing5，FNDC5）的表达，FNDC5经过剪切和修饰，形成产生112个氨基酸的irisin，释放入血［2，23］。Irisin依赖于PGC-1α而发挥作用，可诱导鼠类的白色脂肪转化为棕色脂肪［23，26，31］。Roberts等研究证实了肥胖小鼠的骨骼肌中FNDC5基因存在高表达，这一现象在人体中同样也存在［23］。虽然有较多研究证实了不同运动可以促进高脂喂养肥胖鼠类血浆Irisin和肌肉FNDC5 mRNA表达水平的提升［16，25，28］，而人体中，运动锻炼对肌肉FNDC5 mRNA表达和血浆Irisin水平的作用还有较多争议［1，9，11，17，20］。Frode Norheim［19］观察到受试者12周运动训练后安静时肌肉中PGC-1α和FNDC5水平显著增加，且呈高度相关，但是血浆Irisin水平下降，皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织也都没有显著改变；而让这些受试者以70%O2max强度运动45 min后，发现运动后循环血中Irisin增加约1.2倍。我们的研究中，中等强度组与大强度组运动后即刻骨骼肌FNDC5 mRNA相对表达量显著上升（P＜0.05），小强度运动与安静组相比无显著性差异，而4个组的血清Irisin浓度无显著性差异（P＞0.05），这与Frode Norheim的结论相类似［19］，即短期的训练（相当于30 min）不能有效的增加血清Irisin浓度。另外，本研究中不同组别的运动致使小鼠FNDC5 mRNA相对表达量的增加却不能转化为血浆Irisin水平的增加，小鼠骨骼肌FNDC5 mRNA相对表达量与血清Irisin含量也没有存在显著性相关（P=0.496）。或许可以用Raschke的研究观点来解释［21］，即人类和鼠科动物的起始密码子存在差异（人体中是ATA，而鼠科动物中是ATG），造成了人体FNDC5蛋白翻译失去了自己的信号肽，将近50%的Irisin序列被逆转录载体HEK293细胞转录成较低效率。因此，运动持续时间与增进骨骼肌中PGC1α、FNDC5 mRNA的表达和Irisin的含量的研究还需继续深入。

在小鼠中，FNDC5被认定为是PGC-1α的靶基因。在PGC-1α转基因增强型小鼠中骨骼肌FNDC5的表达增加，而PGC-1α基因敲除的小鼠中FNDC5表达降低。Frode Norheim［19］研究认为，PGC-1α mRNA水平与骨骼肌FNDC5显著相关。我们的研究也进一步证实了这一观点：小鼠骨骼肌PGC-1α mRNA相对表达量与FNDC5 mRNA相对表达量显著正相关（P=0.000，R2=0.783），提示，PGC-1α可能与FNDC5转录调控有关。

大多数慢性疾病的病理与持续性、低剂量、无菌性炎症紧密相联，肥胖症同样如此。白色脂肪组织中巨噬细胞的活化增加了促炎细胞因子的分泌，身体的一些外围器官与组织液出现类似的反应。诸如，肝脏和骨骼肌出现胰岛素的抵抗和其他方面的失调，因此，通过运动扭转炎性过程或许可以减少慢性病的发生［6］。炎症反应过程对于肌肉的生理过程尤为重要，尤其是对于运动的适应。肌肉收缩和肌纤维的损伤紧密相联，运动后不同类型细胞也会激活修复和再生能力，细胞损伤和释放趋化因子来激活和吸引更多的免疫细胞。肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）等相关因子建立促炎环境。TNF-α是炎症发展阶段中的关键因子，它参与了机体的炎症与免疫应答的调整。近年来，多项研究证实了高脂饮食诱导的肥胖动物模型或人群血清TNF-α水平的显著升高，同时降低了脂联素的水平（两者虽然化学结构类似，共用一个信号通道，但是生物学效应却截然相反），这将影响机体胰岛素的信号传导，从而加重肥胖人群的脂肪变性和炎症反应［7，10］。PGC-1α在骨骼肌和一些细胞中，减少了致炎基因的表达。本研究也证实了肥胖小鼠骨骼肌PGC-1α与TNF-α之间存在显著相关性（P=0.043），且与对照组相比，3组不同运动组的血清TNF-α水平显著性降低（P＜0.01）。这可能提供肌肉氧化代谢和炎症反应之间相互拮抗的肌肉分子机制。体力活动可以有效地减少疾病中病理性的慢性炎症，尽管炎症反应和运动之间存在着非常复杂的关系。例如，极大强度的运动会造成过量的炎性反应致使免疫系统的短暂性抑制［6］。

4 小结

1急性有氧运动可以显著增强PGC-1α及其下游因子的转录与翻译水平；

2小鼠骨骼肌氧化代谢和炎症反应之间可能存在相互拮抗的肌肉分子机制。

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Effects of Acute Aerobic Exercise with Different Intensities on Regulating PGC-1α and Its Downstream Factors in Obese Mice

ZHU Xiao-feng1，WANG Ru2，YANG Qin2，MAYun3，TIAN Qian-qian2，YANG Ya-bing2

Objective：To observe the effects of acute aerobic exercise with various intensities on the transcription and translation levels of PGC-1α and its downstream factors in obese mice through the high-fat diet induced mice obesity models，with an aim to further explore the physiological mechanism of PGC-1α signal in exercise for weight loss.Methods:C57BL/6J male mice were randomly divided into control group（group C），low intensity group（group SE），moderate intensity group（group ME），and high intensity group（group HE）after successful modeling induced by high-fat diet.The latter 3 groups were given one-time treadmill training at different intensities and were sacrificed immediately after exercise.Serum TNF-α，IRISIN，MCAD and CPT-1 contents were determined by ELISA；and relative expression quantities of PGC-1α and its downstream factors PPARγ，PPARβ，TNF-α and FNDC5 mRNA in skeletal muscle were detected by means of qRT-PCR.Results:Compared with group C，the serum MCAD value in group SE was significantly improved（P＜0.05）；TNF-α in group ME and HE was remarkably decreased（P＜0.05；P＜0.01）；while differences in CPT-1 and Irisin among four groups showed no statistical significance（P＞0.05）.Compared with group C，relative expression quantities of PGC-1α mRNA in skeletal muscle in groups SE，ME and HE were notably enhanced（P＜0.01）；those of PPARγ mRNA in groups ME and HE were markedly up-regulated（P＜0.05；P＜0.01）；those of PPARβ mRNA in groups ME and HE were distinctly improved（P＜0.01；P＜0.05）；those of TNF-α mRNA in three exercise groups were down-regulated apparently（P＜0.01）；and those of FNDC5 mRNA in groups ME and HE were outstandingly elevated（P＜0.05）.Relative expression quantity of PGC-1α mRNA in skeletal muscle showed significantly positive correlation with that of FNDC5 mRNA（P＜0.01）；that of FNDC5 mRNA had low correlation with serum Irisin content（P＞0.05）；and that of PGC-1α mRNA in skeletal muscle showed remarkably positivecorrelation with serum TNF-α content（P＜0.05）.Conclusion:Acute aerobic exercise can significantly enhance the transcription and translation levels of PGC-1α and its downstream factors. There may be an antagonistic muscular-molecular mechanism between the oxidative metabolism and the inflammatory response of skeletal muscle in mice.

aerobic exercise；diabetes；PGC-1α；Irisin；TNF-α；FNDC5

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2016-09-08；

：2017-02-10

国家自然科学基金项目（81472148）；浙江省国民体质与健身技术研究重点实验室科研项目（2011F10052-14［2016］）

朱小烽，男，浙江绍兴人，讲师，在读博士研究生，研究方向为运动与健康促进，Tel：0573-85235984，E-mail:zhuxiaofeng102@126.com；王茹，女，博士，副教授，博士研究生导师，研究方向为儿童青少年肥胖与健康促进；E-mail：wangru0612@163.com；杨钦，男，在读博士研究生，研究方向为运动、肥胖与健康促进。

1.嘉兴学院师范学院，浙江嘉兴314200；2.上海体育学院上海市人类运动能力开发与保障重点实验室，上海200438；3.国家体育总局运动医学研究所，北京100061

1.Jiaxing University，Jiaxing 314200，China；2.Shanghai Unversity of Sport，Shanghai 200438，China；3.Nationa1 Research Institute of Sport Medicine，Beijing 100061，China.