心肌线粒体自噬相关蛋白BNIP3在运动预适应晚期保护效应中的变化

万栋峰，潘珊珊，原阳

心肌线粒体自噬相关蛋白BNIP3在运动预适应晚期保护效应中的变化

万栋峰，潘珊珊，原阳

目的：检测和观察心肌线粒体自噬相关蛋白BNIP3在运动预适应（EP）晚期保护效应中的表达变化，探讨EP晚期保护效应和心肌线粒体自噬的关系。方法：SD大鼠随机分为对照组（C组）、力竭运动组（EE组）、晚期运动预适应组（LEP组）、晚期运动预适应+力竭运动组（LEP＋EE组）和wortmannin+晚期运动预适应+力竭运动组（W+LEP+EE组）。在EP动物模型的基础上，用力竭运动致大鼠急性心肌损伤，用血浆cTnI含量和HBFP染色综合评价心肌损伤和保护的程度，用免疫荧光双标法检测大鼠心肌线粒体BNIP3和TOM20的共定位程度，用免疫印迹法检测大鼠心肌组织线粒体BNIP3和LC3的表达变化。结果：与C组相比，EE组血浆cTnI和MOD值显著升高，BNIP3转位线粒体程度、BNIP3水平和LC3II/I水平显著升高；LEP组BNIP3转位线粒体程度和BNIP3水平显著升高，血浆cTnI、MOD值和LC3II/I水平无显著性差异。与EE组相比，LEP+EE组血浆cTnI和MOD值显著降低，BNIP3转位线粒体程度、BNIP3水平和LC3II/I水平显著降低。与LEP+EE组相比，W+LEP+EE组血浆cTnI和MOD值显著升高，BNIP3转位线粒体程度和BNIP3水平显著升高，LC3II/I水平无显著性差异。结论：EP可促使线粒体自噬相关蛋白BNIP3表达升高，在EP晚期心肌保护效应中，BNIP3诱导的线粒体自噬参与了EP对运动性心肌损伤的保护作用。

BNIP3；LC3；心肌线粒体自噬；运动预适应；晚期保护效应

细胞自噬（Autophagy）是细胞通过捕获自身变形、衰老和损伤的蛋白质或细胞器，然后在溶酶体内降解消化并重新利用的过程［4，14］，它是真核细胞所特有的一种高度保守的细胞稳态过程。在饥饿、运动等应激条件下，细胞自噬被激活或增强，成为维持细胞稳态和生存的内源性保护机制［14］。根据自噬对降解底物的选择性，将自噬分为选择性和非选择性自噬，而线粒体自噬（mitophagy）属于选择性自噬，指在氧化应激、能量代谢、细胞衰老等刺激下，细胞内的线粒体发生去极化损伤，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中，并与溶酶体融合，从而完成损伤线粒体的降解，维持细胞内环境的稳定［6，20］。有研究表明，线粒体自噬的程度与自噬相关蛋白的变化密切相关［8，26，28］。Bcl-2 19-kDa相互作用蛋白3（Bcl-2 19-kDa interacting protein 3，BNIP3）作为Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白，它不仅参与细胞凋亡，还调控细胞自噬，在促进细胞存活的自噬过程中具有重要作用，并能与受损线粒体结合参与线粒体自噬［26］。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3）是自噬体形成关键蛋白，可以反映自噬体的形成，它存在两种可以相互转化的形式LC3I和LC3II，LC3II是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增多，因此，LC3II/I比值在一定程度上可以反映自噬水平［8］。在自噬体成熟阶段，BNIP3会募集LC3至线粒体上，促进自噬体的形成［28］，并积极清除受损线粒体，诱导线粒体自噬。

反复短暂的心肌缺血使心肌在后续的长时间缺血中得到保护的现象称缺血预适应（ischemic preconditioning，IP）。反复短时间大强度间歇有氧运动能提高心肌耐受缺血缺氧的能力，使心肌在后续的持续性缺血损伤中得到保护，这种通过运动诱导机体产生内源性心肌保护效应的方式称运动预适应（exercise preconditioning，EP）［8，12，24］，与IP的过程类似。EP可以降低心律失常和心肌顿抑的发生［25］，减少心肌梗塞面积，提高心肌在缺血再灌注（ischemic reperfusion，IR）中的耐受力［11］，减轻缺血心肌细胞结构的损伤，降低力竭运动所致的心肌损伤［17］。EP和IP一样具有早期和晚期两个保护期，早期保护期在运动刺激后即刻出现，持续1-3 h；晚期保护期在运动刺激后12 h发生，24-48 h达到顶峰，持续24-72 h，与早期保护期相比稳定性更明显。因此，探讨EP的晚期保护效应对于长期的心肌保护更有意义。EP的保护效应机制涉及运动模型和运动强度的制定，氧化缓冲能力的提高，心肌细胞膜ATP敏感钾通道亚基的上调，心肌线粒体的适应性改变等［12］，但其机制至今还不十分明了，尚待探寻新的研究切入点。目前，细胞自噬与IP及运动保护关系的探讨正成为新的研究热点。有研究表明，IP和运动对心肌都具有适应性保护作用［21，24］，IP心肌保护效应存在线粒体自噬的增强［18，23］。运动后，为调控体内的线粒体质量水平，机体会通过自噬途径降解受损的线粒体，同样也存在线粒体自噬的增强［27］。因此，我们假设EP晚期保护效应与心肌线粒体自噬存在关联，本实验在我们课题组前期研究的基础上，以线粒体自噬相关蛋白BNIP3和LC3为切入点，检测和观察BNIP3和LC3在EP晚期保护效应中的变化，探讨EP晚期保护效应和心肌线粒体自噬的关系，为EP心肌保护效应及机制的研究提供更新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠100只，体重252±11 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。大鼠常规分笼饲养（5只/笼），辐照鼠用灭菌饲料（苏州双狮实验动物饲料科技有限公司）饲养。室温22℃～24℃，空气湿度40%～70%，光照时间为12h/d。大鼠适应性饲养一周，期间进行5天速度为15 m/min、时间10 min，坡度为0°的适应性跑台训练。适应性训练结束后休息1天，然后对大鼠体重分层，随机分为5组，每组20只：对照组（control group，C组）；力竭运动组（excessive exercise group，EE组）：大鼠在跑台上进行速度为30m/min的运动直至力竭，以建立大鼠急性运动性心肌损伤模型；晚期运动预适应组（late exercise preconditioning group，LEP组）：大鼠在跑台上进行速度为30 m/min（相当于75%VO2max）的间歇运动，运动10 min，休息10 min，重复4次，坡度为0°，运动结束24 h后进行取材；晚期运动预适应+力竭运动组（late exercise preconditioning+excessive exercise group，LEP＋EE组）：大鼠先进行一次EP模型运动，24 h后进行力竭运动；渥曼青霉素（wortmannin）+晚期运动预适应+力竭运动组（wortmannin +late exercise preconditioning+excessive exercise group，W+LEP+EE组）：在EP运动前0.5 h腹腔注射wortmannin（美国Cell Signaling公司，0.7 mg/kg体重），EP运动结束后24 h进行力竭运动。wortmannin是细胞自噬抑制剂，该组旨在探讨细胞自噬与EP晚期保护效应的关系。

1.2 动物取材

用10%水合氯醛（40 mg/100 g体重）对大鼠进行腹腔麻醉。打开腹腔，下腔静脉取血5 ml，静置15～30 min，离心取血浆，-80℃保存，用于血浆心肌肌钙蛋白（Icardiac troponin I，cTnI）含量检测。取血后，每组大鼠随机抽取10只，打开胸腔，暴露心脏，沿心尖插入灌注针头，1%肝素抗凝，滴注0.85%生理盐水250～300 ml，剪断下腔静脉，待流出液基本无血色后，继续滴注4%多聚甲醛250～300 ml。取出心脏，生理盐水漂洗，放置4%多聚甲醛中后固定24 h，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，用于心肌HBFP染色和免疫荧光双标实验。另外每组10只大鼠迅速打开胸腔，摘取心脏，生理盐水漂洗，-80℃保存，用于心肌组织免疫印迹实验。

1.3 血浆cTnI含量检测

采用化学发光法（ChemiLuminescence，CL）测定血浆cTnI含量。CL是一种双位点酶免法检测。将与碱性磷酸酶结合的单克隆抗cTnI抗体，连同含表面活性剂的缓冲液和样本，加入到反应管中。短时间孵育后，加入包被有抗cTnI单克隆抗体的顺磁性微粒。cTnI与抗cTnI抗体在固相上结合，抗cTnI抗体-碱性磷酸酶结合物与cTnI分子上的不同抗原位点反应。添加化学发光底物（Lumi-Phos* 530）到反应管中，用光度计对反应产生的光进行测量。发光量与样本中cTnI的浓度成正比，仪器为Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系统，样本内分析物的量根据所储存的多点校准曲线确定，测量范围为0.02～100 ng/ml。

1.4 心肌组织HBFP染色

苏木素-碱性复红-苦味酸染色（hematoxylin basic fuchsin picric acid staining，HBFP染色）可以显示心肌组织的缺血缺氧变化。正常心肌组织被染成黄色，缺血缺氧心肌组织则被染成艳红色。先将石蜡切片进行常规脱蜡至水，用苏木精浸染细胞核，0.1%碱性复红中浸染3 min，流水冲洗。之后用丙酮浸洗10 s，再用0.1%苦味酸丙酮浸染15～20 s，丙酮浸洗20 s。染色结果用Olympus DP80显微镜进行观察并采集图像。每组随机选取5张组织切片，每张切片随机采集5个视野，在同一放大倍数下（×400），用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0对每个视野进行图像分析，测量参数选取目标物质的缺血缺氧面积和积分光密度（integral optical density，IOD），并用平均光密度（mean optical density，MOD）表示缺血缺氧单位面积的损伤程度（MOD=IOD/阳性面积）。

1.5 心肌组织BNIP3和TOM20免疫荧光双标实验

多数蛋白进入线粒体内部发挥作用均需通过线粒体外膜转位酶（translocase of the outer mitochondrial membrane，TOM）系统的转运，TOM20是线粒体TOM系统的相关组成亚基，定位于线粒体外膜［7］。因此，本实验通过TOM20识别和定位线粒体，采用免疫荧光双标检测BNIP3和TOM20的表达及共定位程度。石蜡切片常规脱蜡至水，滴加消化液，PBST冲洗3次，滴加山羊血浆封闭液。BNIP3和TOM20共定位，需加入一抗（兔抗大鼠BNIP3，1: 200，美国abcom公司；小鼠抗大鼠TOM20，1:200，美国Santa Cruz公司），4℃孵育过夜，PBST冲洗3次，同时滴加FITC，Cy3标记的混合二抗（FITC标记山羊抗兔IgG，1: 200，碧云天生物技术有限公司；Cy3标记山羊抗小鼠IgG，1:200，碧云天生物技术有限公司），标记BNIP3为绿色，TOM20为红色，两者荧光融合区域显示为黄色，用激光共聚焦显微镜Zeiss LSM700观察免疫荧光结果并采集图像，每组随机选切片5张，每张切片随机选5个视野，在同一放大倍数下（×400），用计算机图像分析软件Zen 2012（black version）进行荧光强度和共定位分析。BNIP3的荧光强度可反映BNIP3在胞质内的表达量，TOM20的荧光强度可反映线粒体的表达量，两者的共定位可反映BNIP3转位线粒体的程度。

1.6 心肌组织线粒体BNIP3免疫印迹实验

大鼠左心室切取小块组织，称重，冰浴下在EP管中剪碎，加入线粒体裂解液（MS buffer）提取线粒体蛋白，低温匀浆，4℃下进行1 000 g和3 000 g的差速离心，沉淀为线粒体，上清为剩余胞浆。BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度。使用SDS-PAGE电泳，5%脱脂奶粉于室温中孵育1～2 h，加入一抗（兔抗大鼠BNIP3，1:1 000，美国abcom公司），4℃过夜，TBST洗膜5次后加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1:3 000，武汉谷歌生物科技有限公司），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入发光液，用Tanon 5200 Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统曝光，利用Image J分析软件测定BNIP3条带灰度值及对应的内参COXⅣ条带的灰度值。BNIP3相对灰度值以BNIP3灰度值/COXⅣ灰度值表示，代表BNIP3的水平变化。

1.7 心肌组织LC3免疫印迹实验

大鼠左心室切取小块组织，称重，冰浴下在EP管中剪碎，加入蛋白质抽提剂提取LC3，低温匀浆超声，4℃下12 000 rpm离心取上清。BCA法测定蛋白浓度。使用SDS-PAGE电泳，5%脱脂奶粉于室温中孵育1～2 h，加入一抗（兔抗大鼠LC3，1:500，美国NOVUS公司），4℃过夜，TBST洗膜5次后加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1:3 000，武汉谷歌生物科技有限公司），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入发光液，用Tanon 5200 Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统曝光，利用Image J分析软件测定LC3条带及对应的内参β-action条带的灰度值。LC3相对灰度值以LC3灰度值/β-action灰度值表示，代表LC3的水平变化，用LC3II/I比值反映自噬水平的高低。

1.8 数据统计与分析

实验数据由SPSS 17.0软件处理，结果以均数±标准差（±SD）表示，组间比较采用One-wayANOVA检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 血浆cTnI含量的变化

各组大鼠血浆cTnI含量的变化如表1所示。与C组相比，EE组血浆cTnI水平明显升高，差异具有显著性（P＜0.05），而LEP组血浆cTnI水平无显著性差异（P＞0.05）；与EE组相比，LEP+EE组血浆cTnI水平明显下降，差异具有显著性（P＜0.05）；与LEP+EE组相比，W+LEP+EE组血浆cTnI水平明显升高，差异具有显著性（P＜0.05）。

2.2 心肌组织HBFP染色结果

大鼠心肌组织HBFP染色结果显示，C组心肌组织横切和纵切面（图1-A、1-B）显示，心肌细胞界限清楚，染色均匀，胞浆呈黄色，细胞核呈蓝紫色位于细胞中央，未见艳红色缺血缺氧改变。EE组（图1-C）心肌细胞界限不清楚，组织染色不均匀，可见大量斑块状或片状艳红色染色，与C组（图1-A）相比，有明显的缺血缺氧改变。LEP组（图1-D）细胞界限清楚，仅有少量斑块状艳红色染色。LEP+EE组（图1-E）部分心肌细胞界限不清楚，心肌组织中出现部分艳红色染色，但与EE组（图1-C）相比，缺血缺氧程度降低。W+LEP+EE组（图1-F）心肌细胞界限不清楚，可见大量斑块状艳红色染色，与LEP+EE组（图1-E）相比，缺血缺氧程度增加。

表1 大鼠血浆cTnI水平变化Table 1Changes of Plasma cTnI in Rats（ng/ml）

图1 大鼠心肌组织HBFP染色结果×400Figure 1.Results of HBFP Staining in Rats Myocardium×400

心肌组织HBFP染色图像分析结果如表2所示，心肌组织缺血缺氧面积和IOD值变化趋势相近，故用MOD值表示各组大鼠心肌组织中单位面积内缺血缺氧的程度。与C组相比，EE组MOD值显著增加，差异具有显著性（P＜0.05），而LEP组MOD值无显著性差异（P＞0.05）。与EE组相比，LEP+EE组MOD值显著减少，差异具有显著性（P＜0.05）。与LEP+EE组相比，W+LEP+EE组MOD值显著增加，差异具有显著性（P＜0.05）。

表2 大鼠心肌组织HBFP染色结果图像分析Table 2Image Analysis of HBFP Staining in Rats Myocardium

2.3 心肌组织BNIP3和TOM20免疫荧光双标实验结果

大鼠心肌组织BNIP3和TOM20免疫荧光双标实验结果显示，C组（图2-A）BNIP3呈绿色，TOM20呈红色均散在分布于胞质中，BNIP3和TOM20共定位呈黄色分布于胞质内，Dapi标记的细胞核呈蓝色，位于细胞中央；与C组（图2-A）相比，EE组（图2-B）、LEP组（图2-C）BNIP3绿色荧光强度和黄色重叠区域面积出现不同程度增加，提示BNIP3转位线粒体不同程度的升高；与EE组（图2-B）相比，LEP+ EE组（图2-D）绿色荧光强度减弱，黄色重叠区域面积减少，提示BNIP3转位线粒体程度降低。LEP+EE组相对LEP组，TOM20荧光强度减弱，提示线粒体存在减少。与LEP+EE组（图2-D）相比，W+LEP+EE组（图2-E）绿色荧光强度增强，黄色重叠区域面积增加，提示BNIP3转位线粒体程度升高。

各组大鼠心肌组织BNIP3和TOM20荧光强度以及两者的共定位百分比结果如表3所示。心肌组织BNIP3荧光强度结果，与C组相比，EE组BNIP3荧光强度显著升高（P＜0.05），LEP组和LEP+EE组BNIP3荧光强度无显著性差异（P＞0.05）；与EE组相比，LEP+EE组BNIP3荧光强度显著降低（P＜0.05）；与LEP+EE组相比，W+LEP+EE组BNIP3荧光强度显著升高（P＜0.05）。心肌组织TOM20荧光强度结果，与C组相比，EE组、LEP组和LEP+EE组TOM20荧光强度无显著性差异（P＞0.05）；与EE组相比，LEP+EE组TOM20荧光强度显著降低（P＜0.05）；与LEP+ EE组相比，W+LEP+EE组TOM20荧光强度显著升高（P＜0.05）。BNIP3对TOM20共定位百分比结果，与C组相比，EE组和LEP组BNIP3对TOM20共定位百分比显著升高（P＜0.05）；与EE组相比，LEP+EE组BNIP3对TOM20共定位百分比显著降低（P＜0.05）；与LEP+EE组相比，W+ LEP+EE组BNIP3对TOM20共定位百分比显著升高（P＜0.05）。

图2 大鼠心肌组织BNIP3和TOM20免疫荧光双标实验结果×400Figure 2.Double Immunofluorescence Results of BNIP3 and TOM20 in Rats Myocardium×400

表3 大鼠心肌组织BNIP3和TOM20免疫荧光双标实验图像分析Table 3.Image Analysis of Double Immunofluorescence of BNIP3 and TOM20 in Rats Myocardium

2.4 心肌组织线粒体BNIP3免疫印迹实验结果

大鼠心肌组织线粒体BNIP3 western blot检测结果如图3所示。与C组相比，EE组和LEP组BNIP3水平显著增高（0.23±0.09 vs.0.11±0.08，0.25±0.16 vs.0.11±0.08，P＜0.05）；与EE组相比，LEP+EE组BNIP3水平显著降低（0.10±0.09 vs.0.23±0.09，P＜0.05）；与LEP+EE组相比，W+ LEP+EE组BNIP3水平显著增高（0.35±0.33 vs.0.10±0.09，P＜0.05）。

图3 大鼠心肌组织线粒体BNIP3水平变化Figure 3.Change of Mitochondria BNIP3 Level in Rats Myocardium

2.5 心肌组织LC3免疫印迹实验结果

大鼠心肌组织LC3 western blot检测结果显示，LC3I组间无差异（P＞0.05，图4）。与C组相比，EE组LC3II水平显著升高（0.56±0.38vs.0.26±0.20，P＜0.05）；与C组相比，LEP组和LEP+EE组LC3II水平无显著性差异（P＞0.05），但具有一定升高趋势；与EE组相比，LEP+EE组LC3II水平显著降低（0.32±0.12vs.0.56±0.38，P＜0.05，图5）。与C组相比，EE组LC3II/I比值显著升高（1.87±1.24 vs.0.81±0.56，P＜0.05）；与C组相比，LEP组和LEP+EE组LC3II/I比值无显著性差异（P＞0.05），但具有一定升高趋势；与EE组相比，LEP+EE组LC3II/I比值显著降低（1.12±0.68 vs.1.87± 1.24，P＜0.05，图6）。

图5 大鼠心肌组织LC3II水平变化Figure 5.Change of LC3II Level in Rats Myocardium

图6 大鼠心肌组织LC3II/I水平变化Figure 6.Change of LC3II/I Level in Rats Myocardium

3 分析和讨论

3.1 运动预适应晚期心肌保护效应与细胞自噬的关系

已有较多研究证实，EP的晚期心肌保护效应。Domenech等［11］用狗进行速度为6 km/h，运动5 min，休息5 min，重复5次的一次间歇跑台运动建立EP模型，在EP结束后24 h，结扎冠状动脉前降支60 min，再灌注270 min，发现心肌梗死面积较对照组减少46%，提示EP诱导的晚期保护效应可以减轻IR损伤。Hao等［17］用大鼠进行速度为30 m/min，运动10 min，休息10 min，重复4次的一次大强度间歇跑台运动诱导EP心肌保护效应，在EP结束后24 h，对大鼠进行一次力竭运动，证实EP诱导的晚期保护效应可以减轻力竭运动所致的心肌损伤。cTnI是心肌细胞特有的收缩调节蛋白，在检测运动性心肌损伤中有其独特的优势［29］。当心肌细胞缺血缺氧损伤时，细胞膜的通透性和完整性发生改变，导致血液中cTnI升高。HBFP染色是一种检测早期心肌缺血缺氧的形态学指标，它利用缺血缺氧心肌的亲复红性原理，显示心肌组织的缺血缺氧改变。Gerche等［13］在探讨运动性右心室功能紊乱和结构重塑的过程中，发现血液cTnI含量与右心室功能紊乱关系密切，他们对40名训练有素的耐力运动员进行一次耐力运动，运动结束后即刻检测血液cTnI含量，发现所有运动员血液cTnI含量显著升高，右心室功能下降，一周后右心室功能得到恢复。刘泽广等［3］在探讨EP保护效应和B型钠尿肽关系的研究中，曾采用血浆cTnI检测和HBFP染色方法，从血液和组织学两个方面综合评价心肌损伤和保护的程度。本实验在EP模型的基础上，在EP结束后24 h，对大鼠进行一次大强度力竭运动，探讨EP对力竭运动的晚期保护效应，并通过血浆cTnI含量和HBFP染色综合评价运动性心肌损伤和保护的程度。与C组相比，LEP组大鼠血浆cTnI水平和HBFP染色的MOD值无显著性差异，进一步证实EP是一种无损伤性预适应方式；EE组大鼠血浆cTnI水平和HBFP染色的MOD值明显升高，提示一次大强度力竭运动导致大鼠运动性心肌损伤。与EE组相比，LEP+EE组大鼠血浆cTnI水平和HBFP染色的MOD值明显降低，进一步证实EP诱导的晚期保护效应可以减轻力竭运动所致的心肌损伤。

目前，在细胞自噬和心肌保护作用的研究中，细胞自噬抑制剂已得到广泛应用。Huang等［19］用Langendorff灌注的大鼠心脏探讨自噬在IP心肌保护的作用，在IP开始前，先灌注自噬抑制剂Tat-ATG5K130R15 min，然后再进行I/R损伤，结果显示，IP后10 min细胞自噬增强，使用自噬抑制剂Tat-ATG5K130R后IP的心肌保护作用减弱，提示细胞自噬在IP诱导的心肌保护中发挥作用。刘艺等［2］为探讨自噬在IP减少急性心肌I/R损伤中的作用，采用冠脉结扎术建立大鼠急性心肌I/R损伤模型，在IP开始前15 min腹腔注射自噬抑制剂wortmannin，结果显示，当wortmannin抑制细胞自噬后，IP的心肌保护作用减弱，提示细胞自噬在IP减轻I/R损伤中发挥重要作用。本实验已经证实，EP诱导的晚期保护效应可以减轻力竭运动所致的心肌损伤，为进一步探讨细胞自噬与EP晚期保护效应的关系，在EP前0.5 h腹腔注射自噬抑制剂wortmannin，特别设计W+LEP+ EE组。结果显示，与LEP+EE组相比，W+LEP+EE组大鼠血浆cTnI水平和HBFP染色的MOD值明显升高，提示抑制自噬使EP对运动性心肌损伤的晚期保护作用减弱，细胞自噬部分参与EP的晚期保护效应。

3.2 BNIP3诱导线粒体自噬与运动预适应晚期保护效应的关系

BNIP3作为Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白，它不仅参与细胞凋亡，还调控细胞自噬，在促进细胞存活的自噬过程中具有重要作用，并能与受损线粒体结合参与线粒体自噬［26］。BNIP3在正常生理条件下可通过C-末端定位在线粒体外膜和内质网上，表达水平较低［1，16］。在心肌中，缺血缺氧条件下BNIP3会急剧升高，高表达的BNIP3绝大多数也定位在线粒体外膜［26］。此时细胞受到刺激被活化，由单体形式转变为二聚体形式，二聚体形式的BNIP3会募集LC3，与线粒体紧密结合，激活线粒体自噬［16］。本实验在一次大强度的力竭运动中，免疫荧光双标和免疫印迹实验结果显示，EE组BNIP3转位线粒体的程度和表达量都要显著高于C组，这一结果进一步证实，HBFP实验结果中力竭运动导致缺血缺氧损伤程度的升高，与BNIP3向线粒体外膜转位以及在线粒体上表达量的升高存在关联。EE过程中线粒体自噬的激活，其可能与较高的线粒体损伤程度之间存在联系。王文成等［5］在探讨力竭运动对心肌线粒体功能的影响及与运动性疲劳关系的研究中，发现力竭运动可造成线粒体和心肌损伤，力竭运动后24 h各项指标基本恢复。在EP模型中，与C组相比，LEP组BNIP3转位线粒体的程度和表达量显著增加，这一结果提示，LEP促使BNIP3表达量升高，也可以诱导线粒体自噬，但与EE诱导的线粒体自噬可能存在差异，期间并不依赖缺血缺氧损伤程度的改变，说明LEP期间线粒体损伤本身并不严重，可能是TOM20没有明显变化的原因。血浆cTnI结果和HBFP染色结果显示，EP是一种无损伤性预适应方式，而这种保护效应可能通过BNIP3诱导的线粒体自噬发挥作用。Hamacher等［15］探讨BNIP3在心肌I/R损伤中的作用研究中，发现在I/R损伤模型中，BNIP3通过上调自噬水平和清除受损线粒体产生保护效应，减轻I/R所致的心肌损伤。一次短时间大强度运动会造成心肌短暂的相对或绝对缺血缺氧，Band等［9］在大鼠心脏组织的研究中发现，在缺氧条件下，BNIP3表达量的升高依赖于缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的升高，同时BNIP3的表达可以有效地诱导线粒体自噬。反复短暂大强度的EP，通过引起较低程度的组织相对缺血缺氧，可能也诱导了HIF-1α依赖的BNIP3升高。免疫荧光双标和免疫印迹实验结果显示，与EE组相比，LEP+EE组BNIP3转位线粒体的程度和表达量显著降低，而与C组相比，LEP+EE组BNIP3转位线粒体的程度和表达量无显著性差异，保持在同一水平。LEP+EE组大鼠先进行一次EP模型运动，发现尽管与C组相比，LEP组BNIP3转位线粒体的程度和表达量显著升高，但24 h后进行力竭运动，线粒体自噬效率升高，可能是导致LEP+EE组BNIP3转位线粒体的程度和表达量显著降低的因素［30］。在此期间TOM20荧光强度的显著降低，说明LEP+EE组线粒体清除数量显著增高，并抑制了EE引起的BNIP3增高，在避免了BNIP3诱导的前凋亡因素情况下，也激活了自噬［16］。这一结果提示在EP晚期心肌保护效应中，BNIP3诱导的线粒体自噬参与了EP对运动性心肌损伤的保护作用。

3.3 LC3依赖的线粒体自噬与运动预适应晚期保护效应的关系

BNIP3诱导了自噬在线粒体上的识别，依赖与之相关的细胞内LC3形成连续的自噬过程［16］。LC3可以反映自噬体的形成，它存在两种可以相互转化的形式LC3I和LC3II，LC3II是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增多，因此，LC3II/I比值在一定程度上可以反映自噬水平［8］。研究发现，BNIP3在成年大鼠心肌细胞中可以有效地诱导细胞自噬［26］。Chen等［10］证实，在缺氧的情况下，随着缺氧时间的延长，活化BNIP3会导致LC3II不断积累。本实验免疫印迹结果显示，与C组相比，EE组细胞内LC3II水平和LC3II/I比值显著升高，提示BNIP3有充足的LC3可以募集至线粒体，对诱导线粒体自噬具有潜在性，但也发现，EE无法引起TOM20荧光强度的显著降低，提示EE期间的受损线粒体可能未有效清除，推测EE过程中需降解的损伤物质大量产生，造成自噬体的代谢障碍引起堆积，是线粒体自噬过程受阻的主要原因。Ogura等［22］，在研究了一次30 min，30 m/min的大鼠跑台模型后不同时间点的变化规律，发现运动后即刻LC3II表达水平显著降低，而在1 h时超量恢复超过运动前达到峰值，3 h时出现回落接近运动前。与C组相比，LEP组LC3II水平和LC3II/I比值尽管无显著性差异，但具有一定升高趋势，可能与LC3II在EP结束后24 h存在回落有关［22］，结合BNIP3转位线粒体程度和表达量的显著升高，提示LEP虽然不会引起缺血缺氧损伤加剧，但可以诱导BNIP3预先合成和大量转位促进自噬的潜在性表达。与C组相比，LEP+EE组LC3II水平和LC3II/I比值无显著性差异，但具有一定升高趋势。与EE组相比，LEP+EE组LC3II水平和LC3II/I比值显著降低，同时TOM20荧光强度也显著降低，结合BNIP3转位线粒体的程度和表达量，提示LEP诱导的BNIP3和细胞自噬的升高存在关联，在随后的EE过程中，自噬体和线粒体数量相对EE组都有显著降低，BNIP3与LC3两者充分发挥了线粒体自噬的保护作用，从而有效清除了受损线粒体，是LEP+EE未引起缺血缺氧损伤的重要原因。综上，本实验表明，LC3依赖的线粒体自噬通过BNIP3的诱导，在EP晚期心肌保护效应中发挥重要作用。

4 结论

EP可以减轻一次大强度力竭运动对心肌所造成的运动性损伤，细胞自噬部分参与EP的晚期保护效应。一次大强度力竭运动和EP均会导致BNIP3表达升高，参与诱导心肌细胞线粒体自噬。在EP晚期心肌保护效应中，BNIP3诱导的线粒体自噬参与了EP对运动性心肌损伤的保护作用。

［1］李丽君，唐圣松.BNIP3调控肿瘤细胞自噬及凋亡的研究进展［J］.临床与病理杂志，2014，34（6）:779-785.

［2］刘艺，徐卫娟，柯丽，等.自噬在缺血预适应减少急性心肌缺血-再灌注损伤中的作用［J］.微循环学杂志，2013，23（3）:16-18.

［3］刘泽广，潘珊珊，郝喆，等.运动预适应保护效应中大鼠心肌B型钠尿肽表达的变化［J］.体育科学，2014，34（9）:31-38.

［4］钱帅伟，罗艳蕊，漆正堂，等.细胞自噬的分子学机制及运动训练的调控作用［J］.体育科学，2012，32（1）:64-70.

［5］王文成，刘克敏.力竭运动对小鼠心肌线粒体自由基代谢和线粒体功能的影响［J］.广州体育学院学报，2008，28（1）: 106-107.

［6］谢洪，李艳君，陈英玉.线粒体自噬［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011，27（12）:1081-1087.

［7］薛强，裴海峰，段海霞，等.线粒体TOM系统在心血管疾病中的研究现状［J］.心脏杂志，2014，26（2）:214-217.

［8］原阳，潘珊珊.活性氧介导氧化应激在心血管应激及运动中对心肌线粒体和自噬作用的新进展［J］.体育科学，2015，35（5）:71-77.

［9］BAND M，JOEL A，HERNANDEZ A，et al.Hypoxia-inducedBNIP3 expression and mitophagy:in vivo comparison of the rat and the hypoxia-tolerant mole rat，Spalax ehrenbergi［J］. FASEB J:Official Pub Fed Am Soc Exp Biol，2009，23（7）: 2327-2335.

［10］CHEN J L，LIN H H，KIM K J，et al.Novel roles for protein kinase C delta-dependent signaling pathways in acute hypoxic stress-induced autophagy［J］.J Biol Chem，2008，283（49）: 34432-34444.

［11］DOMENECH R，MACHO P，SCHWARZE H，et al.Exercise induces early and late myocardial preconditioning in dogs［J］. Cardiovas Res，2002，55（3）:561-566.

［12］FRASIER C R，MOORE R L，BROWN D A.Exercise-induced cardiac preconditioning:how exercise protects your achybreaky heart［J］.J Appl Physiol，2011，111（3）:905-915.

［13］GERCHE A L，BURNS A T，MOONEY D J，et al.Exerciseinduced right ventricular dysfunction and structural remodelling in endurance athletes［J］.Eur Heart J，2012，33（8）:998-1006.

［14］GOTTLIEB R A，MENTZER JR R M.Autophagy:an affair of the heart［J］.Heart Fail Rev，2013，18（5）:575-584.

［15］HAMACHER-BRADY A，BRADY N R，LOGUE S E，et al. Response to myocardial ischemia/reperfusion injury involves Bnip3 and autophagy［J］.Cell Death Dif，2007，14（1）:146-157.

［16］HANNA R A，QUINSAY M N，OROGO A M，et al.Microtubule-associated protein 1 light chain 3（LC3）interacts with Bnip3 protein to selectively remove endoplasmic reticulum and mitochondria via autophagy［J］.JBiol Chem，2012，287（23）:19094-19104.

［17］HAO Z，PAN S-S，SHEN Y-J，et al.Exercise preconditioninginduced early and late phase of cardioprotection is associated with protein kinase C epsilon translocation［J］.Cir J，2014，78（7）:1636-1645.

［18］HUANG C，ANDRES A M，RATLIFF E P，et al.Preconditioning involves selective mitophagy mediated by Parkin and p62/SQSTM1［J］.PloS one，2011，6（6）:1-13.

［19］HUANG C，YITZHAKI S，PERRY C N，et al.Autophagy induced by ischemic preconditioning is essential for cardioprotection［J］.J Cardiovas Trans Res，2010，3（4）:365-373.

［20］LEMASTERS J J.Selective mitochondrial autophagy，or mitophagy，as a targeted defense against oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and aging［J］.Rejuven Res，2005，8（1）:3-5.

［21］MARONGIU E，CRISAFULLI A.Cardioprotection acquired through exercise:the role of ischemic preconditioning［J］.Cur Cardiol Rev，2014，10（4）:336-348.

［22］OGURA Y，IEMITSU M，NAITO H，et al.Single bout of running exercise changes LC3-II expression in rat cardiac muscle［J］.Biochem Biophys Res Comm，2011，414（4）:756-760.

［23］PENG W，LIU Y，XU W J，et al.Role of Beclin 1-dependent autophagy in cardioprotection of ischemic preconditioning［J］. J Huazhong U Sci Tech Med Sci，2013，33（1）:51-56.

［24］POWERS S K，SMUDER A J，KAVAZIS A N，et al.Mechanisms of exercise-induced cardioprotection［J］.Physiol，2014，29（1）:27-38.

［25］QUINDRY J C，HAMILTON K L.Exercise and cardiac preconditioning against ischemia reperfusion injury［J］.Cur Cardio Rev，2013，9（3）:220-229.

［26］QUINSAY M N，THOMAS R L，LEE Y，et al.Bnip3-mediated mitochondrial autophagy is independent of the mitochondrial permeability transition pore［J］.Auto，2014，6（7）:855-862.

［27］SALMINEN A，KAARNIRANTA K，KAUPPINEN A.Crosstalk between oxidative stress and SIRT1:impact on the aging process［J］.Int J Mol Sci，2013，14（2）:3834-3859.

［28］SANDOVAL H，THIAGARAJAN P，DASGUPTA S K，et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells［J］.Nature，2008，454（7201）:232-235.

［29］SHAVE R，BAGGISH A，GEORGE K，et al.Exercise-induced cardiac troponin elevation［J］.J Am College Cardio，2010，56（3）:169-176.

［30］WU H M，JIANG Z F，DING P S，et al.Hypoxia-induced autophagy mediates cisplatin resistance in lung cancer cells［J］. Sci Rep，2015，5:12291.

Changes of Myocardial Mitophagy Related Protein BNIP3 during Late Cardioprotection of Exercise Preconditioning

WAN Dong-feng，PAN Shan-shan，YUAN Yang

Objective:To detect and observe the change of mitophagy related protein Bcl-2 19-kDa interacting protein 3（BNIP3）expression during late cardioprotection of exercise preconditioning，and to determine the relationship between late cardioprotection of exercise preconditioning and myocardial mitophagy.Methods:SD rats were divided into control group（C），EE group，LEP group，LEP＋EE group，and W+LEP+EE group.After establishing of EP animal model，exhaustive exercise on treadmill for inducing myocardial injury.Then the level of cTnI and hematoxylin basic fuchsin picric acid（HBFP）staining were used to evaluate the degree of myocardial injury and protection.Double immunofluorescence was used to evaluate the transposition of BNIP3 and TOM20.Western blotting method was used to detect change of BNIP3 and LC3.Results:As compared with the group C，the cTnI level in plasma and mean optical density（MOD）increased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria，the level of BNIP3 and LC3II/I increased significantly in group EE；While compared with the group C，there was no significant difference in the cTnI level，MOD and the level of LC3II/I in group LEP，but the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria and the level of BNIP3 increased significantly.As compared with the group EE，the cTnI level in plasma and MOD decreased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria，the level of BNIP3 and LC3II/I decreased significantly in group LEP+EE.As compared with the group LEP+EE，the cTnI level in plasma and MOD increased significantly，the degree of the transposition of BNIP3 to mitochondria and the level of BNIP3 increased significantly in group W+LEP+EE.But there was no significant difference in the level of LC3II/I in group W+LEP+EE.Conclusion:Exercise preconditioning can induce mitophagy related protein BNIP3 to increase expression，and the mitophagy induced by BNIP3 participated in late cardioprotection of exercise-induced myocardial injury preconditioning during late cardioprotection of exercise preconditioning.

1000-677X（2017）03-0035-09

10.16469/j.css.201703004

G804.7

：A

2016-07-15；

：2017-02-24

国家自然科学基金资助项目（31471136）。

万栋峰，女，在读硕士研究生，研究方向为运动与心血管形态和机能，E-mail：derfulwon@126.com；潘珊珊，女，教授，博士，博士研究生导师，研究方向为运动与心血管形态和机能，Tel：（021）51253252，E-mail：panshanshan@sus.edu.cn。

上海体育学院运动科学学院，上海200438

Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China.

Key words:BNIP3；LC3；myocardial mitophagy；exercise preconditioning；late cardioprotection