三元乳癖消凝胶膏质量标准研究

王卓 程玉钏 李媛媛 郭丁丁 倪艳

摘要：目的 建立三元乳癖消凝胶膏的质量标准，增强该制剂的质量可控性。方法 采用薄层色谱法对三元乳癖消凝胶膏中三棱、大皂角、香附和急性子进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定方中延胡索乙素含量。色谱柱：Waters symmetry柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：乙腈∶0.1%磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6.4）=55∶45；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm。结果 制剂中三棱、大皂角、香附和急性子的薄层色谱斑点清晰，分离度好；延胡索乙素含量在0.092～1.84 ?g范围内具有良好的线性关系，平均加样回收率为100.15%，RSD=1.58%（n=6）。结论 本研究所建立的方法简便、准确、重复性好，可用于三元乳癖消凝胶膏的质量控制。

关键词：三元乳癖消凝胶膏；急性子；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.019

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0078-04

Study on Quality Standard of Sanyuan Rupixiao Gel Paste WANG Zhuo1， CHENG Yu-chuan1， LI Yuan-yuan1， GUO Ding-ding1， NI Yan1， HAO Xu-liang1， KONG Peng2， YAO Jiao-ni2， LIANG Ze2 （1. Shanxi Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030012， China； 2. Shanxi Fengyuan Pharmaceutical Industry， Ruicheng 044600， China）

Abstract： Objective To establish the quality standard for Sanyuan Rupixiao Gel Paste. Methods Sparganii Rhizoma， Gleditsiae Sinensis Fructus， Cyperi Rhizoma and Impatientis Semen were identified by TLC method. The content of tetrahydropalmatine was determined by HPLC. Waters symmetry column was used with the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphatic acid in a gradient manner （pH was adjusted to 6.4 by triethylamine） （55：45） at the detection wavelength of 280 nm. The flow rate was 1.0 mL/min at the column temperature of 30 ℃. Results The spots in TLC were clear without any interference； tetrahydropalmatine showed a good linear relation in the range of 0.092–1.84 ?g； the average recovery was 100.15% with RSD of 1.58% （n=6）. Conclusion The method is simple and accurate with high reproducibility， which can be used for the quality control of Sanyuan Rupixiao Gel Paste.

Key words： Sanyuan Rupixiao Gel Paste； Impatientis Semen； quality standard； TLC； HPLC

三元乳癖消凝膠膏处方来源于永济电机厂医院刘世泽的临床经验方，由三棱、大皂角、延胡索、天葵子、香附、急性子等10味药组成，具有行气活血、通络止痛、软坚散结功效，适用于气滞血瘀型乳癖，是治疗乳腺增生的有效方剂。该制剂具有膏体载药量大、起效快速、生物利用度高等优势，特别适合于中药浸膏制剂[1-3]，然而该制剂目前尚无质量控制标准。为控制本品质量，更好地保证临床疗效，本研究建立三棱、大皂角、香附和急性子的薄层色谱鉴别方法，对君药延胡索的活性成分延胡索乙素进行含量测定[4-6]，并优化供试品前处理条件，为三元乳癖消凝

基金项目：山西省科技重大专项研究项目（20121101014）

通讯作者：郝旭亮，E-mail：hxliang-01@163.com

胶膏制订准确可靠的质量控制标准。

1 仪器与试药

MS101-1型电热恒温干燥箱（上海市松江县枫泾机电厂），939型薄层制板器（重庆南岸贝尔德仪器技术厂），UV-8型三用紫外分析仪（上海分析仪器厂无锡分厂），BP211D型电子天平（德国Startorius），薄层色谱用硅胶G、GF254、H（青岛海洋化工有限公司）。美国戴安U3000高效液相色谱仪；VWD-3X00紫外检测器；Waters symmetry色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

三棱对照药材（批号121521-201103）、大皂角对照药材（批号121611-201001）、急性子对照药材（批号121606-201001）、α-香附酮对照品（批号110748- 200507）、延胡索乙素对照品（供含量测定用，批号110726-201011，纯度以99.9%计），中国食品药品检定研究院；三元乳癖消凝胶膏（批号20131001、20140501、20140502、20140503）及缺味药材阴性凝胶膏，山西丰源药业有限公司。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 三棱 取本品2片，剪碎，除去盖衬，加乙醇60 mL，加热回流1 h[3]13，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解并转移至分液漏斗，加二氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，加乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取三棱对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。另取缺三棱的阴性样品，同法制成三棱阴性对照溶液。照薄层色谱法（2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10 ?L、对照药材溶液5 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮（5∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.1.2 大皂角 取本品2片，剪碎，除去盖衬，加甲醇60 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL，转移至分液漏斗，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解[3]21，过中性氧化铝柱（100～200目，3 g，内径2 cm）上，以甲醇洗脱至无色，弃去甲醇溶液，再用85%甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取大皂角对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取缺大皂角的阴性样品，同法制成大皂角阴性对照溶液。照薄层色谱法（2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10 ?L、对照药材溶液5 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸（16∶1∶0.6∶0.2）的下层溶液为展开剂，饱和1 h，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.1.3 香附 取本品2片，剪碎，除去盖衬，置具塞锥形瓶中，加石油醚50 mL，密塞，摇匀，浸渍1 h，时时振摇，过滤，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液[3]258。另取缺香附的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成香附阴性对照溶液。照薄层色谱法（2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10 ?l、α-香附酮对照品溶液2/3 ?L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（60∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（254 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.1.4 急性子 取本品2片，剪碎，除去盖衬，加乙醇20 mL，超声处理30 min，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取急性子对照药材2 g，同法制成對照药材溶液。另取缺急性子阴性样品，同法制成急性子阴性对照溶液。照薄层色谱法（2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲苯-乙醇（20∶1）为展开剂[4]，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）延胡索项下延胡索乙素含量测定方法及文献[5-6]，经调整完善后确定。色谱柱：Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：乙腈∶0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.4）=55∶45；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃。理论塔板数按延胡索乙素峰计算应不低于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成92 ?g/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，剪碎，混匀，取约10 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入2%盐酸水溶液150 mL，密塞，称定质量，浸润过夜，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）90 min，放冷，再称定质量，用2%盐酸水溶液补足减失的质量，过滤，取续滤液。将续滤液低温（≤60 ℃）浓缩至30 mL，加浓氨调节pH值至9.5±0.2，用甲苯振摇提取4次，每次30 mL，合并甲苯提取液，低温水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺延胡索药材的阴性凝胶膏，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 专属性试验 将对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液分别进样10 ?L，依法测定，结果供试品溶液中待测成分色谱峰与延胡索乙素对照品色谱峰保留时间一致，阴性对照溶液无干扰，表明本方法专属性良好。色谱图见图1。

2.2.6 线性关系考察 精密称取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1 mL含92 ?g的溶液。分别精密吸取1、2、5、10、15、20 ?L进样，依法测定，以延胡索乙素含量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程Y=10.297X+0.001 6，r=1。表明延胡索乙素进样量在0.092～1.84 ?g范围内具有良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 取同一对照品溶液（92 ?g/mL），按上述色谱条件连续进样6次，每次10 ?L测定，计算延胡索乙素峰面积积分值RSD=0.17%，表明仪器的精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，每隔2.5 h测定1次，共进样5次，结果延胡索乙素峰面积RSD=0.69%，表明供试品溶液中延胡索乙素含量在10 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取同一批三元乳癖消凝胶膏（批号20131001），按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。结果延胡索乙素的平均含量为39.78 ?g/g，RSD=1.58%，表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知延胡索乙素含量的同一批三元乳癖消凝胶膏样品（批号20131001）6份，每份约5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.2.11 样品含量测定 取三元乳癖消凝胶膏3批样品（批号20140501、20140502、20140503）中延胡索乙素含量进行测定。按供试品溶液的制备方法操作，精密吸取供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，计算样品中延胡索乙素的含量，结果见表2。

3 讨论

三元乳癖消凝胶膏因其处方药味较多，加之药用辅料凝胶基质的存在，故易造成供试品与对照药材相应位置斑点重叠、斑点颜色不一致等，难以达到鉴别效果，且大皂角、香附和急性子在复方制剂中的薄层鉴别方法报道很少。在预试验中，笔者曾参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）对大皂角、香附和急性子进行薄层色谱鉴别，因其背景及基质影响严重，且急性子阴性存在干扰。经多次试验，大皂角采用中性氧化铝柱进行纯化后干扰消失，斑点显现；香附将乙醚改用石油醚作为提取溶剂较药典方法（乙醚），背景色明显变浅，斑点清晰；急性子改用乙醇直接超声提取，层析用板由硅胶G薄层板改用硅胶H后，阴性干扰消除，同时操作简单快速，方法稳定，层析效果理想，可作为急性子薄层鉴别的常用方法；此外，环境相对湿度对三棱的薄层色谱行为有较大影响，故宜快速点样，若空气湿度较大，可在双槽展开缸展开剂的另一侧加入适量浓硫酸。

在对延胡索乙素含量进行测定时，由于凝胶基质的干扰、药材之间的相互影响，以及延胡索乙素的热不稳定性，本研究对供试品溶液的制备方法进行了优化，选择超声提取方法，并考察了不同提取溶剂（甲醇、2%盐酸水溶液、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮）及其用量（100、150、200 mL）对检测样品的影响，结果选择2%盐酸水溶液150 mL时有效成分延胡索乙素的提取率最高；另外，由于本品凝胶基质的影响，超声浓缩后溶液较为黏稠，所以采用不同极性的有机试剂（石油醚、甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷）對超声溶液进行萃取，最终选定甲苯作为萃取溶剂，萃取4次，即可达到检测要求。

参考文献：

[1] 宋立华，刘淑芝.中药凝胶膏剂的研究进展分析[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（22）：133-136.

[2] 刘月环，陆洋，杜守颖，等.宣痹凝胶帖膏剂有效成分的透皮行为研究[J].中国中药杂志，2012，37（9）：1202-1205.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[4]“急性子鉴别（急性子显微鉴别︱急性子理化鉴别）”[EB/OL]. [2011-04-22].http：//www.zhongyao.org.cn/ys/jg/201104/247204.html.

[5] 郭汉文，王怡君，孔黎冰，等.HPLC法测定骨友灵贴膏中延胡索乙素的含量[J].中国药品标准，2007，8（4）：32-34.

[6] 余琰，魏舒畅，韩涛，等.奇应内消巴布剂定性定量方法研究[J].药物分析杂志，2012，32（1）：132-135.

（收稿日期：2016-05-17）

（修回日期：2016-06-06；编辑：陈静）