热毒清口服液质量控制方法的改进

王盛 陈莉 冯艺戎 蔡敏

摘要：目的 改进热毒清口服液的质量标准。方法 采用薄层色谱法对方中的甘草、射干、黄芩进行鉴别；采用高效液相色谱法测定热毒清口服液中黄芩苷的含量。结果 薄层色谱法能够鉴别出甘草、射干、黄芩的特征斑点；黄芩苷在53.60～536.00 ?g/mL范围内呈良好的线性关系（r=0.999 99），平均加样回收率为99.85%，RSD=0.63%（n=6）。结论 本方法操作简单，准确可靠，可有效控制热毒清口服液的质量。

关键词：热毒清口服液；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量控制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.018

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0075-03

Improvement of Quality Standard of Reduqing Oral Liquid WANG Sheng1，2， CHEN Li1，2， FENG Yi-rong1，2， CAI Min1 （1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China； 2. State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China）

Abstract： Objective To improve the quality standard of Reduqing Oral Liquid. Methods TLC was used to identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； HPLC method was usded to detect the contents of Baicalin in Reduqing Oral Liquid. Results TLC could identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； Baicalin was detected in range of 53.60–536.00 ?g/mL with good linear relationship （r=0.999 99）， the average recovery rate was 99.85%， and RSD was 0.63% （n=6）. Conclusion The method is simple， accurate and reliable， which can be applied to the quality control of Reduqing Oral Liquid.

Key words： Reduqing Oral Liquid； TLC； HPLC； quality control

热毒清口服液为安徽中医药大学第一附属医院临床专家，依据中医学家姜春华的“截断扭转”学术理论，以“清热解毒凉血，疏风散结消瘀”为治法，创制的在江淮地区具有广泛影响的新安名方制剂。该制剂处方由重楼、黄芩、板蓝根等7味药组成，具有抗病毒、抗菌、解热镇痛等作用[1]，用于治疗流行性感冒，在医院临床应用已近30年。为了更好地控制该制剂的质量，保证临床使用的安全性和稳定性，本研究对热毒清口服液的质量控制方法进行改进，增加甘草、黄芩和射干的薄层鉴别，同时采用HPLC测定黄芩中黄芩苷的含量。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD紫外检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置和自动进样器），安捷伦公司；CAMAG荧光灯，瑞士CAMAG公司；定量毛细管，瑞士CAMAG公司；Sartorius BP211D十

基金项目：安徽省卫生厅中医药科研课题（2012ZY20）

通讯作者：冯艺戎，E-mail：18655182623@163.com

万分之一电子天平，德国塞多利斯公司；HH-S型水浴锅，巩义市英峪予华仪器厂。

甘草对照药材（批号120904-201117）、黄芩对照药材（批号120955-200406）、重楼对照药材（批号121060-201007），中国食品药品检定研究院；热毒清口服液（批号20131227、20140312、20140402），安徽中医药大学第一附属医院制剂中心；色谱甲醇和乙腈，其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 甘草 取本品10 mL，加甲醇30 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[2]80。取甘草药材l.103 g，加乙醚40 mL，超声处理30 min，过滤，弃去醚液，药渣加甲醇30 mL，按供试品溶液制备方法制得对照药材溶液。按处方量及工艺制备缺甘草的阴性对照溶液。照薄层色谱法（2010年版《中华人民共和国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各0.5 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板（用1%NaOH溶液浸渍晾干，105 ℃活化15 min）上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

2.1.2 黄芩 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，加盐酸调pH值为1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取黄芩对照药材1 g，按供试品溶液制备方法制得对照药材溶液。按处方量及工艺制备缺黄芩的阴性对照溶液。照薄层色谱法（2010年版《中华人民共和国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液4 ?L、对照药材溶液2 ?L、阴性对照溶液4 ?L，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁试液，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[3]。

2.1.3 射干 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，加盐酸调pH值1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取射干对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，过滤，滤液浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。按处方量及工艺制备缺射干的阴性对照溶液。照薄层色谱法（2010年版《中华人民共和国药典》一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各4 ?L、阴性对照溶液5 ?L，分别点于聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇（10∶5∶1）为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[2]267。

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Analytical C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇-0.4%磷酸水（47∶53），检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量5 ?L[2]282。理论板数按黄芩苷峰计算不低于2500。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL，加乙醇定容至10 mL，称定质量，超声处理（功率135 W，频率59 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品5.36 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按热毒清口服液处方，称取1/10处方量（缺黄芩）的药材，按工艺制得阴性溶液。精密吸取阴性溶液1 mL，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各5 ?L，注入色谱仪中，测定，色谱图见图1。可见，供试品色谱图在与黄芩苷峰相应的出峰时间上，有对应峰出现，且阴性对照无干扰峰出现。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取黄芩苷对照品溶液（0.536 mg/mL）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取5 ?L，依次注入色谱仪中，按上述色谱条件测定，以黄芩苷进样量为横坐标，相应的峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=2714.828 48X+4.555 6，r=0.999 99（n=6）。黄芩苷在0.268～2.680 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取黄芩苷对照品溶液5 ?L，连续进样6次，依法测定，结果平均峰面积为7254.4，RSD=0.77%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液5 ?L，每隔2 h进样1次，依法测定并计算，结果黄芩苷峰面积RSD=0.20%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 精密量取样品（批号20131216）1 mL，平行6份，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，依次进样测定，结果黄芩苷的平均峰面积为1448.516 7，RSD=0.1795%，表明本方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密量取样品（批号20131216）0.5 mL，平行9份，分别加入黄芩苷对照品适量，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，依次进样，依法测定。结果平均回收率为99.85%，RSD=0.63%，表明该方法准确可靠。

2.2.9 样品含量测定 取6个批样品，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，依次进样，依法测定，结果见表1。

3 讨论

热毒清口服液为复方制剂，成分复杂。为了更好地保证该制剂的药品质量、提高临床疗效，本试验对该制剂处方药味进行了定性鉴别研究，在原有质量标准的基础上，增加了方中甘草、黄芩、射干的薄层色谱鉴别，结果表明该方法专属性强，重复性好，无干扰，斑点清晰；采用HPLC对该制剂中主要有效成分进行了含量测定研究，增加了在该制剂中含量较高的黄芩苷含量测定指标，方法学考察结果表明，本方法精密度高，重复性好。

由于板蓝根与大青叶的成分相似[4]，因此，本试验对板蓝根与大青叶进行合并鉴别研究，采用药典中板蓝根项下薄层鉴别方法，结果双缺阴性试验有干扰，故放弃该制剂中板蓝根与大青叶的薄层鉴别。在重楼的薄层鉴色谱鉴别中，首先采用药典中重楼项下薄层鉴别方法，供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置没有对应斑点；采用文献[5]方法，阴性试验结果有干扰，考虑原因为其他成分的干扰，故放弃该制剂中重楼的薄层鉴别。

HPLC测定热毒清口服液中黄芩苷的含量试验中，对流动相甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）与乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）进行了考察[6-7]。结果以乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）为流动相时，黄芩苷分离度较差，且降低流速后（0.8 mL/ min）黄芩苷分离度R<1.5，对称因子T>1.05，仍然较差；以甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）为流动相，当进样量为10 ?L时，黄芩苷分离度较好，但峰的对称因子T>1.05，调整进样量为5 ?L时，黄芩苷分离度R>1.5，对称因子T在0.95～1.05范围内，符合要求。故最后选用以甲醇- 0.4%磷酸水（47∶53）为流动相，进样量为5 ?L，作为黄芩苷的含量测定条件。

参考文献：

[1] 黃升海，冯晓亮，刘伟.热毒清口服液抑制呼吸道合胞病毒的体外实验研究[J].中药材，2009，32（4）：579-581.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[3] 季申，毛秀红，张彤，等.茵栀黄注射液质量标准研究[J].中成药， 2009，31（12）：1862-1867.

[4] 王瑞，杨海英，杨琪伟，等.板蓝根的质量标准研究[J].中草药，2010， 41（3）：478-480.

[5] 郑艳平，林壮民.蓝菊抗病毒口服液的薄层鉴别[J].中国医药导报， 2010，7（22）：76-78.

[6] 李玲玲，赵兰芬.清开灵不同制剂中黄芩苷的含量测定[J].药物分析杂志，2011，31（5）：950-953.

[7] 刘学杰，姜慧祯，林娜.双贝糖浆中黄芩苷的含量测定[J].西北药学杂志，2011，26（1）：8-10.

（收稿日期：2016-01-06）

（修回日期：2016-05-17；编辑：陈静）