胰高血糖素样肽-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞自噬的影响

张 军，谷 翔，黄问银，张普华，于 欢，殷嫦嫦，王丽丽，毛卫未

(1.南昌大学研究生院医学部,江西 南昌 330006;2.九江学院附属医院心内科,江西 九江 332000；3. 九江学院转化医学实验室,江西 九江 332000)

胰高血糖素样肽-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞自噬的影响

张 军1，2，谷 翔1，2，黄问银2，张普华2，于 欢3，殷嫦嫦3，王丽丽3，毛卫未2

(1.南昌大学研究生院医学部,江西 南昌 330006;2.九江学院附属医院心内科,江西 九江 332000；3. 九江学院转化医学实验室,江西 九江 332000)

目的 观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导H9C2心肌细胞自噬(Autophagy)的影响，初步探讨GLP-1心肌细胞保护作用与自噬活性关系。方法 将传代培养H9C2心肌细胞随机分4组：① Control组：加入0.9%生理盐水；② AGEs组：加入100 mg·L-1AGEs；③ AGEs+GLP-1组：同时加入100 mg·L-1AGEs和10 nmol·L-1GLP-1；④ AGEs+GLP-1+Rapamycin组：同时加入100 mg·L-1AGEs、10 nmol·L-1GLP-1及5 μmol·L-1Rapamycin(自噬诱导剂)。各组在经上述预处理24 h后，分别用CCK-8法检测细胞存活率Hoechst 33258试剂盒检测细胞的凋亡率，DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平，流式细胞术检测细胞自噬溶酶体形成，Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3Ⅱ, Beclin-1)表达。结果 ① 与Control组相比，AGEs组细胞生存率明显减少，细胞内ROS水平明显增高，细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表达均明显增加；② 与AGEs组相比，AGEs+GLP-1组细胞生存率明显增高，细胞内ROS水平、细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表达均明显下降；③ 与AGEs组相比，AGEs+GLP-1+rapamycin组中细胞内ROS水平降低，而细胞生存率、细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表达未见差异。结论 ① AGEs可导致H9C2心肌细胞内ROS升高，诱导细胞损伤并激活细胞自噬；② GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用，其保护机制可能与抑制细胞自噬活性有关。

胰高血糖素样肽素-1;糖基化终产物; H9C2心肌细胞;自噬;活性氧;细胞保护

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是过量糖与蛋白质、脂质、核酸之间经非酶糖基化反应的终末产物，可通过诱导活性氧(ROS)、细胞凋亡及炎性反应等导致细胞损伤或死亡，在糖尿病心肌病发生发展过程中发挥重要作用[1]。最近研究发现，自噬作为糖尿病心肌病的新颖发病机制，在调节AGEs诱导的心肌细胞凋亡、ROS诱导的糖尿病心肌损伤等方面的作用引起关注[2-3]，有望成为糖尿病心肌病治疗的潜在靶向机制。

胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是机体中一种具有“肠促胰素效应”的肠源性激素，在发挥综合降糖作用外，还可影响糖尿病心肌病的多种发病机制，其中包括缓解糖尿病心肌内质网应激、减少高糖诱导的心肌细胞凋亡等[4-5]。此外，GLP-1还可通过抑制自噬保护高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤[6]，通过减少氧化应激改善冠脉血管内皮损伤[7]，以及减少急性心肌梗死面积及心梗后心肌重构等[8]，这些研究结果提示GLP-1在糖尿病心肌病中的作用及机制值得进一步探究。本研究通过观察GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞ROS及自噬影响，初步探讨自噬在GLP-1糖尿病心肌损伤中的保护作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 H9C2大鼠心肌细胞株由南昌大学第二附属医院实验室细胞库惠赠。AGEs (121800，Calbiochem公司，美国)，DMEM-F12培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(BI公司，以色列)，GLP-1(Sigma公司，美国)，活性氧检测试剂盒、细胞计数CCK- 8试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)，兔抗老鼠GAPDH(10494-1-AP)多克隆抗体(Peprotech公司，美国)，LC-3B(#3868) 、Beclin1(#3495)(CST公司，美国)，吖啶橙(索莱宝公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9C2细胞株复苏后，接种于15% 胎牛血清DMEM-F12培养液中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。在细胞贴壁80%时，用0.25%胰酶消化，取对数生长期的细胞并接种于6孔板中，分别加入0.9%生理盐水、100 mg·L-1AGEs、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycin，并在培养箱中培养24 h后进行各项指标检测。

1.2.2 CCK-8法检测细胞成活率 按照CCK- 8试剂盒说明书操作流程，取对数生长期细胞，以2×107·L-1细胞浓度接种于96孔板中，在37 ℃培养箱中培养2 h后，用酶标仪(Elx800，BioTek，美国)记录450 nm波长处的吸光度。取4孔光密度(optical density，OD)的平均值，按下列公式计算细胞存活率：生存率/%=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。实验重复3次。

1.2.3 Hoechst 33258核染色法检测心肌细胞凋亡 H9C2心肌细胞经不同因素处理后,小心弃去培养基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L-1Hoechst 33258试剂，室温轻摇30 min。在荧光显微镜(BX50-FLA,Olympus,Japan)下摄片,染色质均匀分布,核被染成均匀蓝色的细胞认为是正常细胞，核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色细胞认为是凋亡细胞，随机选取视野在荧光显微镜下摄片。

1.2.4 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平 根据活性氧试剂盒操作流程，标本用10 μmol·L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育20 min。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用 Image J 1.410软件分析4个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的各样本进行统计分析。

1.2.5 流式细胞仪检测自噬溶酶体水平 收集H9C2 细胞，用预冷的PBS洗1次，1 000 r·min-1离心5 min后，加入已配制好的等体积吖啶橙(Acridine orange,AO)染色液，冰上染色10～15 min，样品在1h内用流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国)检测细胞自噬溶酶体水平(激发光488 nm)。

1.2.6 Western blot测定自噬相关蛋白表达 收集H9C2细胞，用预冷的PBS洗涤3次，RIPA全细胞裂解液冰上裂解30 min，离心取上清，BCA法进行蛋白定量。每孔蛋白上样量30 μg在0.1聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳70 V，电泳15～20 min，待指示剂到浓缩胶与分离胶交界处后，改为120 V继续电泳，直至溴酚蓝完全到凝胶底部停止电泳。置于电转液中，在250 mA恒定电流下将蛋白转移至PVDF膜上。50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h，LC3B、Beclin1一抗(1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次。二抗室温孵育1 h，漂洗3次，ECL显色。用ECL 检测液发光显影定影后，用Image J软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 GLP-1减少AGEs诱导 H9C2心肌细胞损伤

2.1.1 各组细胞形态学特征 在倒置显微镜下，各组细胞形态学特征表现为：Control组细胞呈梭形，排列规整，大小均一，胞核、胞质境界清楚；AGEs组细胞大小不规则，一些胞体变圆、皱缩，胞核增大，胞质有空泡出现；AGEs+GLP-1组细胞大小较为均一，形态趋向正常，细胞皱缩变形和胞质空泡化减少；与AGEs+GLP-1组相比，AGEs+GLP-1+rapamycin组细胞形态学损伤较为严重(Fig 1)。

Fig 1 Cellular morphology observation(×400)

A：Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin

2.1.2 各组细胞生存率检测结果 CCK-8法检测各组细胞存活率结果显示，与Control组相比，AGEs 组细胞生存率明显减低(70.16±1.98vs93.37±3.66，P<0.01)；AGEs+GLP-1组较AGEs组明显提高细胞生存率(80.66±1.78vs70.16±1.98，P<0.05)。见Tab 1。

GroupCellviability%ofcontrol(x±sdeviations)Normalcontrol93.37±3.73100mg·L-1AGEs70.16±1.98##100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-180.66±1.78*100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-1+5μmol·L-1rapamy-cin71.58±3.36

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.1.3 各组细胞凋亡率检测结果 Hoechst 33258核染色检测结果显示,与Control比较，100 mg·L-1AGEs处理H9C2心肌细胞24 h能使H9C2细胞凋亡率明显增加；与100 mg·L-1AGEs组损伤相比100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP+5 μmol·L-1Rapamycin与100 mg·L-1AGEs组对比，细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见Fig 2。

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs group.

2.2 GLP-1降低AGEs诱导H9C2心肌细胞内ROS产物 运用荧光探针DCFH-DA对各组心肌细胞内ROS进行标记，用Image J 1.410软件分析荧光强度结果显示(Fig 3)，AGEs组荧光强度明显高于Control组(P<0.01)；与AGEs组相比，AGEs+GLP-1组荧光强度明显减弱(P<0.05)；以上结果提示，AGEs可导致H9C2心肌细胞内ROS升高，GLP-1干预后可明显降低AGEs诱导的细胞内ROS产物。

Fig 3 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.0 1vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.3 GLP-1抑制AGEs诱导的H9C2心肌细胞自噬

2.3.1 流式细胞术检测细胞自噬溶酶体水平结果 A为正常Control组；B为AGEs组；C为AGEs+GLP-1组，D为AGEs+GLP-1+Rapamycin组。运用吖啶橙(Acridine orange, AO)对细胞内酸性囊泡细胞器(包括自噬溶酶体)进行染色标记，经流式细胞仪检测AO荧光强度结果显示(Fig 4)，AGEs组平均荧光强度明显高于Control组(3 302.03±9.84vs162.05±3.20，P<0.01)；在经GLP-1干预后显示，AGEs+GLP-1组平均荧光强度较AGEs组明显减低(2 756.67±3.84vs3 302.03±9.84，P<0.05)；用Rapamycin进一步干预后，AGEs+GLP-1+Rapamycin组平均荧光强度与AGEs组差异无显著性(3 206±8.80vs3 302.03±9.84，P>0.05)。上述结果提示，GLP-1可明显减少细胞自噬溶酶体水平，Rapamycin干预后可削弱GLP-1对细胞自噬溶酶体作用效果。

Fig 4 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.

2.3.2 Western blot法检测自噬相关蛋白表达结果 运用免疫印迹方法分别检测50、100、200 mg·L-1浓度AGEs对H9C2心肌细胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达影响。结果显示，随着AGEs浓度升高，LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达逐步增强，根据实验结果选用100 mg·L-1AGEs作为最适宜自噬激活浓度。与Control组相比，AGEs组中LC3Ⅱ、Beclin1表达均明显增高(P<0.05)，表明AGEs可明显激活自噬，该结果与流式细胞检测结果基本一致；在经GLP-1干预后，自噬相关蛋白表达均明显降低(AGEs+GLP-1组vsAGEs组，P<0.05)(Fig 5)，提示GLP-1可能具有抑制自噬作用。

为了进一步验证GLP-1通过抑制细胞自噬产生心肌损伤保护作用，本研究运用自噬诱导剂rapamycin对GLP-1作用进行干预，结果显示，rapamycin可明显削弱GLP-1对自噬相关蛋白表达的影响(AGEs+GLP-1+Rapamycin组vsAGEs组，P>0.05)。因此，结合rapamycin对细胞损伤和细胞内ROS影响(Fig 1、Tab 1、Fig 2、Fig 3)，本结果提示，GLP-1可通过抑制自噬保护AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤。

Fig 5 Effect of GLP-1 on the autophagy LC3BⅡ,

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsAGEs group

3 讨论

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM )是一种由多重致病机制共同参与的心肌疾病，其中，AGEs在DCM发病进程中的作用尤为关键[9-10]。AGEs可通过两种途径参与DCM致病过程：① 直接导致胶原蛋白分子交联，抑制胶原蛋白降解，进而增加心肌间质纤维化；② 与其受体RAGE结合，诱导ROS形成、炎性反应，进而激活一系列信号转导途径导致心肌细胞损伤[1,11]。最近研究发现，AGEs还可通过与RAGE结合，抑制PI3K/AKT/mTOR途径从而激活自噬引起心肌细胞损伤[12]。因此，自噬在AGEs诱导的心肌细胞损伤过程中的调节作用值得深入探讨。

GLP-1是由肠道L型细胞分泌的一种肠促胰岛素(incretin)，通过促进胰岛细胞增殖、胰岛素分泌，抑制胰岛细胞凋亡、胰高血糖素分泌，发挥综合降血糖的生物学功效。在内皮细胞、胰岛细胞等研究中发现，GLP-1还可通过降低RAGE表达、减少ROS形成或抑制细胞凋亡，发挥抗AGEs诱导的细胞损伤作用[13-15]。 最近研究也证实，AGEs可诱导RAGE受体表达，而GLP-1可抑制RAGE表达及细胞凋亡，进而提高心肌细胞存活率[16-17]。上述研究结果表明，GLP-1对AGEs诱导的细胞损伤保护机制，可能与减少ROS形成、降低RAGE表达及抑制细胞凋亡有关。

本研究结果显示，AGEs可明显诱导H9C2心肌细胞损伤，主要表现为：与Control组相比，AGEs组出现胞体变形、胞核增大、胞质见空泡等细胞形态学损伤；细胞生存率检测结果也显现较低水平。结合ROS检测结果分析，AGEs 组中细胞内ROS升高可能与AGEs诱导的细胞损伤有关，且其损伤程度随AGEs浓度升高而增加。在经GLP-1干预后显示，GLP-1可明显降低由AGE诱导的细胞内ROS形成，并有效改善细胞损伤。以上结果表明，GLP-1可能通过减少细胞内ROS形成而发挥抗AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤作用。

AGEs是诱导细胞内ROS升高的重要原因之一[18]，ROS异常升高除直接通过氧化反应造成细胞DNA、蛋白质损伤外，还可作为信号分子激活细胞内多种应激敏感信号通路，包括自噬信号通路。研究表明，在氧化应激状态下，ROS升高可通过多种分子信号通路诱导自噬发生，而自噬激活后也可通过线粒体自噬、分子伴侣自噬(CMA)等途径来降低ROS水平[19]。目前认为，ROS与自噬之间这种负向反馈机制一般发生在ROS轻微升高情况下，是机体应对氧化应激的一种代偿调节机制；而当ROS过多增高时，自噬会被过度激活，ROS与自噬之间将形成正向反馈调节，诱导细胞进入自噬型细胞死亡[20-22]。从本研究结果分析，AGEs诱导的细胞损伤、ROS升高及自噬活性上调，在经GLP-1干预后出现明显缓解或下降，推测GLP-1可能通过减少ROS形成，将ROS与自噬之间正向反馈关系转变成负向反馈，从而减少由正向反馈带来的不良后果。

为了进一步验证GLP-1心肌保护作用与自噬活性关系，本研究运用自噬诱导剂rapamycin干预发现，rapamycin在不影响ROS水平情况下，可明显削弱GLP-1对AGEs诱导的心肌细胞损伤保护作用，并有效地干扰了GLP-1对自噬溶酶体形成及自噬相关蛋白表达影响。上述结果提示，在AGEs环境下，GLP-1心肌保护作用与自噬抑制存在一定关联，其保护机制除了涉及ROS介导的自噬外，可能还存在其他自噬调节途径。因此，从本研究结果分析，GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用，其保护机制可能部分通过抑制ROS介导的自噬来实现。

(致谢：本实验于九江学院基础医学院转化医学实验室完成。本实验主要参与人谷翔、殷嫦嫦、李卫东老师给予课题设计及修改；黄问银、王丽丽老师给予实验技术指导；张普华、管高鹏、陈文杰同学给予具体实验上的帮助。)

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The protective effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardimyocytes against AGEs-induced injury by inhibiting excessive autophagy

ZHANG Jun1，2,GU Xiang1,HUANG Wen-yin1,ZHANG Pu-hua1,YU Huan3,YIN Chang-chang3,WANG Li-li3,MAO Wei-wei1

(1.DeptofCardiology,AffiliatedHospitalofJiujiangUniversity,JiujangJiangxi332000,China; 2.MedicineGraduateSchool,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3.BasicMedicalCollegeofJiujangUniversity,JiujangJiangxi332000,China)

Aim To investigate the effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury and potential protective mechanisms of autophagy.Methods Cultured H9C2 cardiomyocytes were respectively incubated with 0.9% NaCl,100 mg·L-1AGEs,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycinfor 24 h. Intracellular ROS production was measured by DCFH-DA fluorescent probe.Cell viability was quantified by CCK-8 assay. Nucleus morphology was observed under fluorescence microscope after being incubated with Honchest 33258.The formations of autolysosomes were detected by flow cytometry using the PH-sensitive fluorescent dye acridine orange(OA). Western blot was applied to assess the expression of autophagy-associated protein including LC3Ⅱ, Beclin-1.Results AGEs impaired cell viability, increased intracellular ROS production, enhanced formation of autolysosomes and up-regulated expression of LC3Ⅱand Beclin-1; however, the effect were reversed remarkably by GLP-1. Furthermore, effect of GLP-1 was inhibited by rapamycin(autophagy agonist) in cell viability, amount of autolysosomes, and expression of autophagy-associated protein but not in intracellular ROS production.Conclusion GLP-1 may protect H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury partly by inhibiting excessive autophagy.

GLP-1;AGEs;H9C2 cardiomyocytes;Autophagy;ROS;myocardial preservation

时间：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.024.html

2016-10-24,

2016-12-05

国家自然科学(地区)基金项目(No 81660152);江西省教育厅科技项目(No GJJ09350)

张 军(1989-)，男，硕士，医师，研究方向：糖尿病心肌病发病机制，E-mail：15079265586@163.com； 谷 翔(1967-)，男，博士，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向：糖尿病心肌病、心肌缺血/再灌注的发病机制,通讯作者,E-mail：eagle0094@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.012

A

1001-1978(2017)03-0348-06

R329.24；R329.25；R329.411；R587.2；R977.6