顺铂加重乳腺癌MCF-7细胞DNA损伤促凋亡的研究

袁立明，马 楠，曹交欢，文 艺，刘向光，周纤纤, 匡淑雯, 陶晓军，曾赵军

(1.湖南师范大学医学院药物工程实验室，湖南 长沙 410013；2. 中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南 长沙 410078)

顺铂加重乳腺癌MCF-7细胞DNA损伤促凋亡的研究

袁立明1，马 楠2，曹交欢1，文 艺1，刘向光1，周纤纤1, 匡淑雯1, 陶晓军1，曾赵军2

(1.湖南师范大学医学院药物工程实验室，湖南 长沙 410013；2. 中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南 长沙 410078)

目的 顺铂(DDP)为广谱抗癌药物，本研究探讨其对MCF-7乳腺癌细胞DNA损伤的作用，并研究其引起细胞凋亡的机制。方法 采用DDP(0、2、4、6、8、10 mg·L-1)处理乳腺癌MCF-7细胞48 h,MTT法检测顺铂对细胞活性的抑制作用，并计算IC50; Western blot检测DNA断裂形成的标志分子γ-H2AX及直接感受DNA双链断裂(DSBs)的分子ATM、细胞凋亡信号分子cleaved caspase-3及凋亡相关的蛋白钙蛋白酶calpain的表达。结果 DDP呈浓度依赖性抑制细胞MCF-7活性，IC50为7.57 mg·L-1；与对照组(未采用顺铂处理)相比，顺铂处理组 MCF-7细胞内γ-H2AX、ATM、cleaved caspase-3、calpain的表达量增多。结论 DDP可抑制乳腺癌MCF-7细胞的活性，其机制与促进MCF-7细胞凋亡，诱导DNA双链断裂，上调促凋亡相关蛋白有关。

MCF-7细胞；顺铂；DNA损伤；乳腺癌；增殖；凋亡；IC50

乳腺癌目前已成为威胁妇女生命和健康的头号杀手，倍受世界各国瞩目[1-3]。顺铂(DDP)为广谱抗癌药物，具有细胞毒作用，其主要靶点为DNA，与DNA结合可诱导DNA严重损伤，从而导致细胞凋亡。DNA双键断裂(DSBs)是最严重的DNA损伤之一，γ-H2AX焦点数和DSBs有1 ∶1的关系,γ-H2AX目前已逐渐成为衡量DNA损伤程度的金标准之一[4]。共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)主要介导DSBs诱导的H2AX的磷酸化，并且还能诱导诸多DNA损伤信号通路中的关键应激蛋白，其具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性, 可以作用于下游靶蛋白相应丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)位点, 在DNA损伤识别和修复中处于最关键的位置[5]。Cleaved caspase-3与化疗药物作用引起细胞凋亡密切相关，cleaved caspase-3在胞质中是以无活性的酶原形式存在, 然而，当许多细胞外凋亡信号使之激活为有活性的cleaved caspase-3时, 引起细胞内关键蛋白酶的失活, 导致细胞凋亡[6]。研究表明，钙蛋白酶calpain与肿瘤细胞的凋亡关系十分密切[7]。本研究旨在分析DDP处理乳腺癌MCF-7细胞后发生DNA损伤时所引起的相关蛋白表达的变化情况，运用MTT法、Hoechst 33258荧光染色及Western blot检测DDP处理MCF-7细胞后对细胞凋亡、细胞形态学及凋亡相关蛋白表达的影响, 为顺铂作用乳腺癌MCF-7细胞的DNA损伤反应的研究提供相关的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，来源于1位69岁高加索妇女乳腺癌(腺癌)患者胸膜渗出液中的癌细胞，该细胞株由中南大学分子生物学研究中心提供。培养体系为含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2孵箱中培养。

1.1.2 试剂 DMEM干粉和小牛血清购于美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma；PVDF膜购于罗氏；30% Acr-Bis、1 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、1 mol·L-1Tris-HCl pH 6.8购自碧云天；预染蛋白Marker购自碧云天；100 bp ladder DNA Marker购自Fermentas。

1.1.3 抗体 ATM鼠抗人单抗购于Abcam公司；γ-H2AX(Ser139)兔抗人单抗购于Bioworld公司；cleaved caspase-3(Asp 175)鼠抗人单抗购于Cell Signaling Technology公司； calpain兔抗人单抗、DAB显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司；二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自碧云天生物有限公司。

1.2 MTT测定DDP作用于MCF-7细胞的的IC50值 将对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板中, 每孔加入200 μL，按不同浓度的DDP进行处理(0、2、4、6、8、10 mg·L-1)，每孔加入100 μL无血清的DMEM和20 μL浓度为5 g·L-1的MTT试剂，37℃继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，采用490 nm和630 nm波长在酶标仪上检测各孔吸光度, 记录结果。用各组不同浓度的细胞抑制率及浓度制作标准曲线, 计算IC50值。细胞抑制率/%=(1-实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100%。

1.3 Hoechst 33258荧光染色观察MCF-7细胞凋亡 将对数生长期MCF-7细胞分别接种于混有不同培养液的培养皿中，分别为空白对照组(0 mg·L-1的DDP)、含5%胎牛血清的DMEM、含10%胎牛血清的DMEM、顺铂组(7.57 mg·L-1DDP的培养基2 mL)，接种96孔培养板，每孔600 μL(1.0 ×105细胞/孔)，48 h后，PBS洗涤细胞，加0.5 mL 10 mg·L-1Hoechst 33258荧光染色，37℃ 孵育8 min，PBS洗涤3次，每次5 min, 荧光显微镜下观察细胞形态，重复3次。

1.4 Western blot 把待处理的MCF-7细胞分为实验组和对照组，实验组即DDP组(2、4、6、8、10 mg·L-1)，对照组即空白对照(DDP为0 mg·L-1)。Western blot具体步骤如下:取等质量的各组蛋白质与5×SDS混匀，热变性5 min后点样；用Bio-Rad电泳仪在60 V和浓缩胶中电泳1 h，之后在100 V和分离胶中电泳2～4 h(ATM蛋白分子质量为350 ku，SDS-PAGE凝胶电泳采用7.5%的分离胶，同样的电压下电泳6 h);Bio-Rad湿转膜仪在80 V、200 mA条件下转膜2～3 h(ATM蛋白转膜6 h)；用含3%脱脂奶粉的TBST溶液4℃封闭2～16 h; 用含3%脱脂奶粉的TBST溶液适当稀释一抗，4℃孵育过夜；用含3%脱脂奶粉的TBST溶液适当稀释二抗，室温孵育1.5 h； 用ECL发光试剂盒对PVDF膜蛋白信号曝光显色，ImageQuant350化学发光系统照相保存实验图片。

1.5 统计学处理 用Image J图像扫描分析系统分析目标条带的净光密度值，以SPSS13.0统计软件进行One-way ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 DDP对MCF-7细胞生长的影响 Fig 1结果显示，与对照组(0 mg·L-1的DDP)相比较，DDP对MCF-7细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性，但最终浓度升高时，抑制作用相对减弱，这可能与细胞产生耐药性有关。本实验测得DDP处理MCF-7细胞48 h的IC50为7.57 mg·L-1。

Fig 1 Effect of DDP on cell growth of MCF-7 cell measured by MTT after 48 h(n=3)

2.2 Hoechst 33258荧光染色观察MCF-7细胞凋亡 Fig 2结果可见，对照组细胞核呈圆形，淡蓝色，染色质分布均匀，而DDP处理组细胞核固缩，分叶或碎片状(即凋亡小体出现)，从结果看，顺铂处理组细胞凋亡增加。

Fig 2 DDP effect on apoptosis morphology of MCF-7 cell

A:NC group;B:DMEM+5% FBS group;C:DMEM+10% FBS group;D:5% glucose group;E:Cisplatin group

2.3 Western blot检测DDP处理MCF-7细胞后对相关蛋白表达的影响 使用DDP药物浓度分别为0、2、4、6、8、10 mg·L-1，处理MCF-7细胞48 h，运用Western blot检测γ-H2AX、ATM、caspase-3、calpain的表达变化。结果显示(Fig 3～5)，γ-H2AX、ATM、cleaved caspase-3、calpain的表达随DDP浓度升高而增多。

Fig 3 Protein expressions related toDNA damage,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

Fig 4 Protein expressions related tocell apoptosis,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

Fig 5 Calpain expressions related tocell apoptosis,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

3 讨论

乳腺癌是临床上发病率较高的恶性肿瘤，化疗是众多治疗乳腺癌的重要方式之一[8-9]。DDP是临床治疗肿瘤的广谱抗癌药，DNA 是DDP的主要靶点，DDP结合会导致 DNA 损伤并诱发细胞凋亡。DSBs是DNA损伤的重要表现形式之一，相关研究表明，γ-H2AX可用于检测DSBs, 与同类方法相比具有较好的实用价值[4]。ATM是DNA损伤的直接感受器，DNA在损伤之后，ATM因自身磷酸化而被迅速激活，即使只有少量的DSBs也会促使ATM发生结构的改变[5]。

本次实验中， DDP处理MCF-7细胞48 h后，随药物浓度升高，γ-H2AX与ATM表达量均升高，造成其损伤，进一步影响了一些基因的表达与蛋白的改变。 经7.57 mg·L-1DDP作用 48 h 后, 在排除其他培养基相应成分干扰的前提下，Hoechst 33258染色结果显示, MCF-7细胞的细胞核固缩，分叶或碎片状，核内染色质因为浓集而呈亮蓝色，从形态学角度可以知道, 顺铂明显诱导MCF-7细胞发生了凋亡，超过了其自身修复的能力。

Western blot结果显示，不同浓度的DDP作用MCF-7细胞后，作为细胞凋亡必不可少的关键酶cleaved caspase-3被激活，通过caspase级联反应，促使与细胞凋亡相关的重要蛋白降解，从而引起细胞凋亡。细胞内的钙蛋白酶calpain是一类Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可催化多种底物限制性水解。研究者们多数认为钙蛋白酶与caspase家族共同介导细胞凋亡。有研究发现，钙蛋白酶可以通过水解caspase-7、caspase-10和caspase-12产生活性更强的水解底物，从而促进caspase诱导的细胞凋亡[10]。 近来研究也证实了钙蛋白酶可以通过裂解凋亡相关的Bcl-2家族，以及通过水解途径激活其他促凋亡途径物质如CDK5、APAF1、JNK、JUN、FOS等介导细胞凋亡[11]。这与本实验得到的calpain表达量在MCF-7细胞被给予DDP之后随浓度升高而增多相一致，进一步证实了钙蛋白酶calpain与细胞凋亡有关。这提示我们，抑制细胞内calpain的表达可能对于肿瘤的治疗有促进作用，也为研究calpain的功能提供了科学依据。

综上所述，DDP通过诱导乳腺癌MCF-7细胞DNA损伤，上调与细胞凋亡相关的蛋白表达，从而引起细胞凋亡。

(致谢：本实验在中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心实验室完成。)

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Study of cisplatin aggravating DNA damage and causing a high apoptosis rate on breast cancer MCF-7 cells

YUAN Li-ming1,MA Nan2,CAO Jiao-huan1,WEN Yi1,LIU Xiang-guang1,ZHOU Xian-xian1,KUANG Shu-wen1,TAO Xiao-jun1,ZENG Zhao-jun2

(1.LaboratoryofMedicineEngineering,MedicalCollegeofHunanNormalUniversity,Changsha410013,China;2.MolecularBiologyResearchCenter,XiangyaMedicalCollege,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

Aim To investigate the mechanisms of DNA damage of cisplatin(DDP), a broad spectrum anticancer drug on breast cancer MCF-7 cells and to study the mechanism of apoptosis induced by DDP.Methods MCF-7 cells were treated by DDP(0, 2,4,6,8,10 mg·L-1) for 48 h. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of DDP on MCF-7 cells, and IC50value was calculated. Western blot was adopted to detect the expression of γ-H2AX,which was the marker of DNA double stranded breaks(DSBs) and ATM(sensory molecules of DSBs), the apoptotic signal transduction molecule cleaved caspase-3, and the proteins associated with apoptosis:calpain.Results DDP inhibited MCF-7 cell activity in a concentration-dependent manner and IC50was 7.57 mg·L-1.In contrast to the control group(without DDP treatment), MCF-7 cells with DDP treatment group expressed more γ-H2AX, ATM, cleaved caspase-3 and calpain.Conclusions DDP could inhibit the activity of breast cancer MCF-7 cells. Its mechanisms may be associated with inhibition of MCF-7 cell apoptosis, induction of DNA double strand breaking and the expression of pro-apoptotic protein up-regulating.

MCF-7 cell; cisplatin; DNA damage; breast cancer; proliferation; apoptosis；IC50

时间：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.018.html

2016-10-25,

2016-11-28

国家自然科学基金资助项目(No 30600753，81172154)；湖南省自然科学基金面上项目(No 2016JJ2088);湖南省教育厅资助项目(No 13C541); 湖南省中医药管理局资助项目(No 2015123)

袁立明(1972-),男，硕士，研究方向：恶性肿瘤的自杀基因治疗及应用解剖学,E-mail: yuanlimingtian@126.com; 陶晓军(1981-)，男，博士，讲师，研究方向：纳米药物制剂缓控释和靶向治疗,通讯作者，E-mail: xiaojtao@126.com； 曾赵军(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：人类肿瘤基因治疗、肿瘤DNA损伤与修复、基因的结构与功能的机制,通讯作者，E-mail: zengzj71@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.009

A

1001-1978(2017)03-0334-04

R329.25；R342.3；R737.9；R979.1