细胞外囊泡及其在卵巢癌诊治中的研究进展

兰霄霄，周志阳，徐欣欣，吴雪清

（温州医科大学附属第一医院 妇产科，浙江 温州 325015）

卵巢癌是高度恶性的肿瘤，是妇科癌症相关性死亡的主要原因，主要发生于绝经后的妇女，由于缺乏特异性症状和体征，发现时多为进展期，常伴有广泛的腹腔转移，5年生存率＜25%，预后较差[1]。然而目前常用的筛查方法如血清CA-125测定和经阴道超声或两者联合运用对早期、可治愈性卵巢癌的检出率均不高，因此亟需一种高效的早期筛查方法，以提高卵巢癌的早期检出率。此外，治疗耐药是卵巢癌患者治疗过程中的一大难题，也是引起患者死亡的一个主要原因，但耐药机制目前尚不完全清楚。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一种双层膜囊泡，根据其直径大小、形状、来源等不同可以分为外泌体、微囊泡、癌小体等[2]。EVs几乎可以由所有类型的细胞释放，内含有许多功能活性物质，如蛋白质、脂质、mRNA、microRNA（miRNA）等，能通过水平转移或细胞-受体相互作用来进行内容物的传递，在局部和远处细胞间的信号交流中发挥重要的作用[3]。并且，在正常人群和癌症患者如卵巢癌患者中，EVs的数量及其内容物的组成和含量均有所不同。因此，EVs有望成为卵巢癌早期诊断的生物标志物，为卵巢癌的诊断和治疗提供新的思路。

1 EVs的生物学特点

1.1 EVs的形成与分泌 EVs是由各种类型细胞释放的双层膜囊泡，它们可以被分泌到细胞间隙也可以被分泌到循环体液中并向远处迁移直至被受体细胞摄取[4]。目前的研究主要将EVs分为外泌体和微囊泡两大类。其中外泌体是1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现的，当时被称为“外化囊泡”[5]，是一种直径为30～100 nm的碟形双层膜囊泡。外泌体的形成始于细胞质膜向内出芽，细胞质膜出芽使得膜蛋白被包被在其中形成早期内涵体。内涵体膜进一步收缩入鞘，细胞溶质蛋白和核酸选择性地被包裹入内涵体中形成腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），含有多个ILVs的内涵体则进一步成熟为多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）。随后，成熟的MVBs一部分与胞质中的溶酶体融合被降解，而另一部分则与质膜融合并将其中的ILVs释放到细胞外，这些被释放出细胞的囊泡，就称为外泌体[1，6-7]。外泌体中特异性内容物的选择过程受内体分选转运复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）调控。BAIETTI等[8]发现用RNA干扰沉默ESCRT的关键成分，比如肿瘤易感基因101（TSG101，又称ESCRT-I）、空泡蛋白分选（VPS）22（又称ESCRT-I I）等，明显减少了MCF-7细胞中外泌体的产生与分泌。而外泌体与质膜的融合和释放过程则被认为主要受RAB蛋白家族调控[9]。与外泌体不同，微囊泡直径较大，最大可达1 000 nm，它直接从质膜向外出芽释放到细胞间隙[7，10]。虽然微囊泡和外泌体在直径和形成过程中有明显的差异，但是研究者们认为微囊泡形成过程的调节与外泌体相似，微囊泡和外泌体的拓扑结构相似。此外，近期的研究发现在微囊泡直接从质膜上出芽脱落的过程中，抑制蛋白结构域蛋白1（arrestin domain-containing protein 1，ARRDC1）与ESCRT成分TSG101发生相互作用[11]，这说明微囊泡的形成过程也有ESCRT的参与。因此，目前很多研究不将两者进行详细区分，而直接称为EVs。

1.2 EVs的内容物与功能 细胞之间可以通过释放蛋白质、核酸以及脂质等分子到胞外，与受体结合从而介导细胞间的信号转导。除了这些单分子以外，细胞还可以释放EVs，通过水平转移功能性miRNA和蛋白质等物质到受体细胞，改变受体细胞的功能[3]。其中miRNA通过连接到靶mRNA的3’非编码区进而抑制靶基因翻译为蛋白质。EVs与靶细胞联系的机制目前公认的有以下3种：①直接与靶细胞膜融合，释放内容物到靶细胞中；②通过内吞作用被靶细胞摄取；③识别并结合靶细胞表面的特异性受体[12]。EVs中含有许多功能活性物质，如蛋白质、脂质、核酸，这些物质能随EVs一起出现在大多数循环体液中，而且其内容物的组成及含量与起源细胞、产生方式、细胞状态以及所处的环境相关。肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶及肠组织特异性A33抗原，B细胞来源的外泌体富含CD86和MHC分子，T细胞来源的外泌体表面有促凋亡的FasL受体。EVs的功能取决于其所含有的内容物，而内容物取决于它们的起源细胞。例如，骨细胞释放的微囊泡能激发骨矿化作用[13]，而正常内皮细胞释放的微囊泡则参与血管生成[14]。此外，许多肿瘤细胞释放的微囊泡能够促进肿瘤细胞的侵袭以及免疫逃避作用[15]。

2 EVs在肿瘤发生发展中的作用

虽然在正常生理状态下细胞也会释放EVs，但是在病理状态下会发生EVs的异常释放，并且与疾病的发生、发展息息相关。肿瘤细胞释放微囊泡的数量被证实与肿瘤的侵袭能力相关。已有研究表明，EVs介导物质运输到近邻和远处细胞影响肿瘤发展的许多过程，包括促进血管生成，逃避免疫监视，侵袭转移，耐药等[16]。

2.1 血管生成 血管生成是肿瘤存活和生长至关重要的一个步骤。通过内皮细胞的增殖形成一个血管网浸润入肿瘤，为肿瘤的生长提供营养和氧气，同时排出代谢废物[17]。在正常以及肿瘤状态下，内皮细胞介导的基质重组是血管形成的一个关键步骤，基质降解蛋白酶，尤其是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）能促进这一过程的进行。卵巢癌细胞系，如CABA1和A2780，释放的EVs中含有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及MMPs，能刺激内皮细胞的运动性和侵袭性[18]。除了生长因子和蛋白酶外，EVs还能通过介导miRNA的转运，修饰内皮细胞的翻译以刺激血管形成，进而促进肿瘤血管表型的获得[19]。

2.2 微环境 在肺癌模型中缺氧能诱导肿瘤细胞释放EVs[20]，这表明不利的肿瘤微环境在某种程度上能触发肿瘤细胞释放EVs，进而为肿瘤细胞提供营养和氧气，促进血管的生成。肿瘤微环境中富含肿瘤细胞释放的EVs，近来越来越多的证据表明这种EVs是促进恶性肿瘤进展的一个重要因素。肿瘤细胞能与细胞外基质发生相互作用，并且主动地对微环境进行修饰使其利于自身的生存和发展。而EVs正是介导肿瘤细胞和微环境中其他细胞之间信息交流的重要介质。研究发现，一种侵袭性前列腺癌细胞系PC3释放的微囊泡能触发周围微环境成纤维细胞中细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化，上调MMPs的表达，增加该细胞的活动性并抑制其凋亡。随后，这种活化的成纤维细胞释放的微囊泡促进了前列腺癌细胞的迁移和侵袭[21]。在微环境中，黑色素瘤细胞来源的外泌体通过自分泌/旁分泌信号通路与周围非肿瘤细胞进行信息交流，并对其进行改造，进而促进原始黑色素细胞发生类似上皮间质化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的转变，而EMT能减少细胞之间的黏附，是肿瘤侵袭、转移所必需的一个过程，这就为肿瘤自身的增殖和转移提供良好的微环境。此过程中涉及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的激活，同时还有Let-7i（血清外泌体中一个上皮间质转化的miRNA调节器）的参与，两者共同促进了黑色素瘤的侵袭和转移[22]。因此，血清外泌体中EMT的miRNA调节器可能成为黑色素瘤转移的一个潜在生物标志或是治疗靶点。

转移前利基形成是大量肿瘤细胞进入候选转移位点前的一个准备环节，这种利基能支持将来肿瘤细胞的植入和存活[23]。研究发现，转移前利基的形成有赖于肿瘤细胞释放的外泌体[24]。COSTASILVA等[25]发现胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）细胞释放含有巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的外泌体能优先连接到肝脏的库普弗细胞上，诱导库普弗细胞释放转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ），后者促进肝星状细胞活化，进而上调纤连蛋白的表达，随后骨髓来源的巨噬细胞被招募到富含纤连蛋白的肝脏位点中，最终导致胰腺导管腺癌转移前利基的形成，为将来PDAC转移到肝脏创造合适的微环境。此外，该团队还发现，与诊断后5年内无明显疾病证据的患者以及健康人群相比，诊断后5年内有进展性疾病的PDAC患者外泌体中MIF的水平明显升高，这意味着外泌体中的MIF有望成为PDAC诊断和预后的生物标志物。

2.3 免疫逃逸 在癌症发展的早期，宿主细胞通过免疫监视引起自发性癌症免疫反应，从而控制癌症的生长。然而随着癌症的进展，肿瘤细胞采取免疫逃避机制沉默自身的免疫原性物质或者活化免疫抑制信号通路使得宿主的这种调控机制失效[26]。VALENTI等[27]在体内外实验中，直接将人黑色素瘤或者结直肠癌细胞释放的微囊泡与单核细胞融合抑制了单核细胞向抗原提呈细胞分化。此外，肿瘤细胞外泌体还能够释放一些因子抑制自然杀伤细胞的活性并诱导T细胞凋亡[28]，说明EVs在肿瘤细胞免疫逃逸过程中起到促进作用。

2.4 侵袭和转移 细胞外基质降解是肿瘤转移过程中必不可少的一个环节。EVs中含有许多蛋白酶，比如MMP2、MMP9以及MT1-MMP等，能促进基质的降解。研究表明晚期卵巢癌患者比早期患者腹水中含有更多数量的EVs[29]，这意味着侵袭性EVs与肿瘤进展之间有相互联系。除了基质降解，血管破坏也是肿瘤侵袭转移的一个重要过程。ZHOU等[30]用转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231（MBC）及正常人上皮细胞MCF-10A所分泌的外泌体作为研究模型，经体内外实验后发现miR-105在MBC外泌体中表达较高。血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1基因的3’UTR区域有2个miR-105结合位点，高表达miR-105的MBC外泌体与该位点结合后能下调血管内皮细胞ZO-1的表达，进而破坏内皮屏障，使得血管通透性提高，而使用抗miR-105复合物则可以有效修复血管通透性，恢复ZO-1表达。这说明肿瘤细胞通过表达并分泌高水平miR-105外泌体，下调内皮细胞中ZO-1的表达，破坏内皮屏障，进而增强肿瘤细胞的浸润转移能力。由于miR-105的促转移作用，它或许可以成为一个用于预测或诊断乳腺癌转移的生物标志物，在了解miR-105的调控机制后，可以更进一步针对其调控通路，设计靶向药物，或直接抑制miR-105，为乳腺癌的治疗提供新策略。

2.5 耐药 耐药问题是肿瘤治疗过程中的一大障碍，是关系肿瘤患者预后的一个重要因素。细胞外囊泡可以通过从肿瘤细胞中排出治疗性药物而促进肿瘤细胞的增殖和进展，进而诱导耐药。SAFAEI等[31]发现顺铂不敏感性肿瘤细胞释放的微囊泡中顺铂的含量是顺铂敏感性细胞释放的微囊泡的2.6倍，这表明EVs可以通过积累并外排化疗药物而参与肿瘤细胞的耐药过程。除了作为药物排出泵，EVs还可以通过改变化疗敏感细胞的基因表达情况来诱导肿瘤细胞耐药。CHEN等[32]分别对耐药乳腺癌细胞系MCF-7/Adr和MCF-7/Doc以及敏感乳腺癌细胞系MCF-7/S释放的外泌体进行miRNA表达谱分析，发现共有441种miRNA在耐药和敏感乳腺癌细胞系中存在差异表达，其中他们选择含有在MCF-7/Adr和MCF-7/Doc细胞系中持续高表达3种miRNA（miR-100、miR-222和miR-30a）的外泌体与MCF-7/S共培养，发现共培养后MCF-7/S释放的外泌体中miR-100、miR-222以及miR-30a的水平也随之上调。此外，TAKAHASHI等[33]发现处于化疗压力下的肝细胞癌细胞及其释放的外泌体中长链非编码RNA-VLDLR（long noncoding RNA-VLDLR，lnc-VLDLR）的表达明显上调，而且将这种外泌体与肝细胞癌细胞共培养后能减少化疗引起的细胞死亡同时上调受体细胞中lnc-VLDLR的表达水平。以上结果说明，耐药肿瘤细胞释放的外泌体能将其中异常增加的核酸转移至敏感肿瘤细胞中，改变后者的基因表达情况，从而诱导肿瘤耐药。

3 EVs在卵巢癌诊治中的作用

3.1 EVs与卵巢癌诊断 随着卵巢癌病情进展，大多数卵巢癌患者会产生恶性腹水，恶性腹水的出现与卵巢癌患者的低预后相关，说明这种复杂的体液可能在卵巢癌的增殖和进展中具有促进作用。研究发现，与早期患者相比，进展期卵巢癌患者腹水中EVs的水平更高，并且囊泡中蛋白质如MMP-2的含量也比早期患者多[29]，这意味着EVs有望成为协助卵巢癌诊断的新生物标志物。

3.2 EVs促进卵巢癌细胞增殖和转移 KELLER等[34]将卵巢癌患者腹水来源的外泌体经腹腔注射到SKOV3细胞移植瘤小鼠体内，每周2次，每次500 μg，25 d后发现与没有外泌体处理的对照组相比，用外泌体处理的小鼠肿瘤体积明显增加，这表明卵巢癌患者来源的外泌体可以促进卵巢癌的增殖。同样地，VAKSMAN等[35]在注射ES2卵巢癌细胞之前用卵巢癌患者胸腹水来源的外泌体预先处理免疫缺陷小鼠，发现与对照组相比，预先用外泌体处理的小鼠身上移植瘤的体积更大，肿瘤的侵袭性更强，而且小鼠的总体生存率也更低。GRAVES等[29]用IV期卵巢癌患者腹水来源的尿激酶纤溶酶原激活剂（uridylyl phosphate adenosineu，uPA）和卵巢癌细胞OVCA429共培养进行细胞侵袭实验，并分析细胞和培养基中的uPA和MMPs的活性，发现与对照组相比，含EVs的OVCA429细胞中uPA的活性增加了2倍，同时细胞的侵袭能力也有所增强，这表明卵巢癌细胞来源的EVs能促进卵巢癌的侵袭转移。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是肿瘤微环境中浸润数量最多的炎性细胞，常表现为M2型，参与卵巢癌早期种植及进一步转移，与患者预后不良密切相关。应翔等[36]将卵巢癌细胞外泌体、M-CSF+IL-4和空培养基分别与人外周血CD14+单核细胞共培养3 d后观察单核细胞的分化情况。流式细胞术检测结果显示，SKOV3外泌体组、M-CSF+IL-4组较空培养基组单核细胞CD206表达升高，HLA-DR表达降低，体外迁移实验显示外泌体组肿瘤细胞迁移数明显增加，表明SKOV3外泌体可诱导单核细胞分化极化为M2型巨噬细胞，进而促进卵巢癌细胞迁移。

3.3 EVs为卵巢癌治疗提供新思路 VAKSMAN等[35]通过对86例卵巢癌患者胸腹水上清中的外泌体进行miRNA表达谱分析发现高水平的外泌体miR21、23b以及29a与卵巢癌患者较差的无进展生存期（progression-free survival，PFS）相关，而高水平的外泌体miR21又与较差的总体生存期（overall survival，OS）相关，说明卵巢癌患者胸腹水中的外泌体miRNA对卵巢癌细胞的生存和进展有影响，这种外泌体miRNA水平可能作为卵巢癌预后的生物标志物，调控这些外泌体miRNA有望成为卵巢癌治疗的新手段。

耐药是肿瘤治疗的一大障碍，除了促进肿瘤的增殖和转移，EVs还与肿瘤的耐药相关。凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor，APAF1）是一种与化疗耐药和凋亡相关的基因，已有研究证明在多数癌症类型中，APAF1的缺失促进了肿瘤细胞的耐药[37]。AU YEUNG等[38]发现卵巢癌网膜肿瘤微环境中基质细胞释放的外泌体能运输其内的miR21到卵巢癌细胞中，通过直接连接到APAF1的编码序列，下调卵巢癌细胞中APAF1的表达，进而抑制卵巢癌细胞的凋亡并促进其获得耐药。虽然大量的研究表明EVs能通过多种途径促进肿瘤化疗耐药，但是也有研究表明它能作为药物运输的介质，聚集化疗药物，携带化疗药物进入肿瘤细胞，减少药物外流，从而提高化疗效率。TANG等[39]用携带有顺铂的卵巢癌EVs治疗接种了卵巢癌细胞A2780的免疫缺陷小鼠，治疗一段时间后发现，与用PBS、顺铂或者不含有顺铂的卵巢癌微囊泡组相比，用携带有顺铂的卵巢癌微囊泡处理的小鼠卵巢肿瘤体积较小并且小鼠的生存期也更长。此外，该团队还发现包载有化疗药物的肿瘤EVs能相对特异地被肿瘤细胞所摄取，诱导肿瘤细胞的凋亡而对周围正常细胞影响较小，摄取了这种EVs的肿瘤细胞还能释放出新的化疗药物包载囊泡，引起多米诺骨牌样肿瘤杀伤作用，大大抑制了肿瘤的生长。以上结果表明，卵巢癌细胞释放的微囊泡也可以作为一种特异性化疗药物运输的介质，并且还能减少化疗带来的不良反应，更好地发挥化疗药物的疗效。

综上所述，EVs是细胞间信息交流的一种重要工具，内含有丰富的生物活性物质，随着研究的进一步深入，我们对EVs的生物学特征也有了更深刻的认识。基于它在肿瘤增殖、侵袭、转移过程中的重要调控作用，近几年来EVs已成为医学领域的研究热点，研究内容也从肿瘤早期筛查的生物标记物扩展到肿瘤治疗靶点等各个方面，为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。目前已有越来越多的证据表明EVs有望成为卵巢癌患者外周血新的生物标记物，有助于解决卵巢癌早期诊断困难的难题，调控特异性EVs的产生和分泌还可能协助卵巢癌的治疗。此外，EVs还可能作为药物定向运输的载体或作用靶点，为临床难治性卵巢癌的治疗提供新的策略。总而言之，关于EVs的研究还只是冰山一角，其更详细的功能还有待于我们进一步的研究与探索。

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