急、慢性乙型肝炎患者浆细胞样树突状细胞与辅助性CD4+T细胞的功能研究

曹卫华 冉崇平 齐天林 王星月 屈晓晶 张丹 张璐 路遥 吴淑玲 郝红晓 常敏 胡蕾苹 刘如玉 吴云忠 杨民 华文浩 刘顺爱 李明慧 谢尧

100015 北京大学地坛医院教学医院肝病中心(曹卫华、谢尧)；100015 首都医科大学附属北京地坛医院肝病中心(冉崇平、齐天林、王星月、屈晓晶、张丹、张璐、路遥、吴淑玲、郝红晓、常敏、胡蕾苹、刘如玉、吴云忠、杨民、李明慧)；检验科(华文浩)；传染病研究所(刘顺爱)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒，乙型肝炎病毒感染是宿主免疫、肝细胞和病毒之间相互作用的动态过程。成人感染HBV后多数表现为急性、自限性(>95%)，但新生儿感染后多数进展为慢性感染(>90%)[1-2]。在HBV感染中，pDCs是固有免疫应答早期抗病毒的主要效应细胞，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。pDCs识别病毒核酸产生大量的I型干扰素，其不仅有强大的抗病毒作用，而且还可以激活NK细胞介导的细胞毒作用以及CD4+T细胞、CD8+T细胞的分化及存活[3-5]。辅助性CD4+T细胞在适应性免疫应答中发挥重要的免疫学效应。在慢性HBV感染中免疫细胞功能受损，而在急性HBV感染中，体内HBV的CD4+T细胞的应答是多克隆的、多特异性的强烈的细胞免疫应答，病毒最终被清除，而在慢性HBV感染中，HBV的特异性细胞免疫反应较弱[6-8]。该研究通过探讨急、慢性HBV感染患者外周血pDC及其表面功能分子的变化以及CD4+T细胞频数，Th1、Th2亚群差异，并分析了它们与HBV DNA、HBV markers、ALT的相关性，从而有助于了解pDC、辅助性CD4+T细胞在急、慢性HBV感染中的作用。

1 材料与方法

1.1患者该研究入组自2014年10月至2017年5月到首都医科大学附属北京地坛医院就诊的123例患者, 包括急性乙型肝炎和慢性乙型性肝炎免疫活动期患者两组，这些患者均为初治患者。其中有11例急乙肝患者在6个月随访中失访。肝炎诊断标准参照文献[9-10]。急性乙型肝炎组诊断标准：有证据证明6个月前无HBV感染，入组时HBsAg阳性，HBeAg和HBV DNA阳性或阴性，ALT异常，Anti-HBcIgM大于10 S/CO或经肝脏组织病理学检查诊断为急性乙型肝炎。慢乙肝免疫活动期(IA)：HBsAg阳性6个月以上，HBV DNA(+)，HBeAg≥100 S/CO，ALT≥150 U/L，且至少有3个月以上的ALT异常史，或肝组织病理学检查显示有明显炎症坏死。排除标准：梅毒、艾滋抗体阳性者，合并HCV, HDV 等其它病毒感染者，伴有其它肝脏疾病者(脂肪肝，自身免疫性肝病，酒精性肝病，肝脏代谢性疾病，肝纤维化，肝硬化以及肝癌)。该研究已通过首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会审核；每位患者均已获得知情同意。入组患者特征如表1所示。

1.2细胞表型染色及流式细胞仪分析用Lineage1-FITC, HLA-DR-PerCP, CD123-APC和CD86-PE四种抗体检测pDC、CD86+pDC，并用FlowJo7.6计算CD86MFI；另外，CD3-PerCP、CD4-FITC、CD45RO-APC和CD62 L-PE四种抗体用于Th1、Th2染色分群：CD3+CD4+CD45RO+CD62 L-为Th1型细胞、CD3+CD4+CD45RO+CD62 L-为Th2型细胞。

1.3临床指标(ALT、HBeAg、HBsAg和HBVDNA)检测患者每3～6个月检测病毒学指标及生化指标，血常规等，这些指标均由首都医科大学附属北京地坛医院检验科提供，采用日立全自动生化分析仪检测肝功能；HBsAg、HBeAg采用Abbott微粒化学发光试剂检测；采用实时荧光PCR(试剂购自上海复兴公司)或罗氏CobasAmpliPrep/CobasTaqMan96全自动实时荧光定量PCR检测试剂检测血清HBV DNA含量。

表2 IA、AHB、AHB-R组间pDC、CD86+pDC、CD4+T细胞频数、亚型及功能分子

注：AHB，急性乙型肝炎组; IA，免疫活动期；AHB-R，急性乙型肝炎恢复期；P<0.05,差异有统计学意义

Notes： AHB，acute hepatitis B; IA, immune activity; AHB-R: acute hepatitis B recovery period;P<0.05 was considered to be statistically significant

1.4统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(mean ± SEM)或中位数、四分位数间距[median(Q1,Q3)]或box-and-whisker plots呈现,利用GraphPad Prism 5分析。组内比较用Wilcoxon检验，多组间两两比较用Mann-Whitney U 检验。变量的相关性分析采用线性回归分析。P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1IA和AHB两组间基线HBVDNA含量、血清HBsAg、HBeAg水平及ALT水平的比较IA组和AHB组间HBV DNA含量、HBsAg水平、HBeAg水平和ALT水平均具有显著性差异(P<0.001)，IA组HBV DNA含量、HBsAg水平、HBeAg水平显著高于AHB组，而ALT水平显著低于AHB组(表1)。

表1 入组患者基本特征

注：AHB，急性乙型肝炎组; IA，免疫活动期;P<0.05 差异有统计学意义

Note：AHB, acute hepatitis B；IA, immune activity；P<0.05 was considered to be statistically significant

2.2在IA和AHB组，pDC频数、CD86+pDC频数以及功能分子表达,CD4+T细胞频数,Th1、Th2亚群细胞频数及Th2/Th1比值表2结果显示：IA组与AHB组相比，pDC频数两组间差异无统计学意义，CD86+pDC频数和CD86MFI水平显著高于AHB组; AHB组CD4+T频数显著高于IA组，而Th2频数、Th1频数、Th2/Th1在两组间差异无统计学意义。AHB组和AHB-R组相比，AHB-R组CD86+pDC频数显著高于AHB组；CD4+T频数、Th1频数两组间虽无统计学差异，但是AHB组CD4+T频数中位数值高于AHB-R组，而AHB组Th1频数中位数值低于AHB-R组。

图1 20例急性乙型肝炎恢复患者外周血CD4+T细胞、Th1、Th2亚群细胞所占的频数及Th2/Th1比值的变化趋势Fig.1 The changed trend of frequency of CD4+T cells, Th1, Th2 subset and ratio of Th2/Th1 in peripheral blood in the recovery of 20 patients with acute hepatitis B

项目ItemAHB⁃IAHB⁃RP入组数(N)Casenumber(N)2020pDC/PBMC(%)median(Q1，Q3)0 20(0 14，0 27)0 21(0 13，0 29)0 743CD86+pDC(%)median(Q1，Q3)18 00(13 13，20 95)22 50(18 48，27 95)0 025CD86MFImedian(Q1，Q3)57 25(49 50，73 43)59 60(47 20，74 40)0 955CD4+T(%)median(Q1，Q3)41 15(35 78，44 63)34 95(26 00，43 65)0 104Th2(%)median(Q1，Q3)40 75(32 33，46 80)37 95(29 80，46 08)0 709Th1(%)median(Q1，Q3)21 25(17 68，32 23)23 60(19 75，28 28)0 940Th2/Th1median(Q1，Q3)1 85(1 29，2 12)1 59(1 16，2 09)0 709

注：AHB-I，急性乙型肝炎炎症期；AHB-R，急性乙型肝炎恢复期；P<0.05,差异有统计学意义

Notes： AHB-I，acute hepatitis B inflammation period; AHB-R，acute hepatitis B recovery period;P<0.05 was considered to be statistically significant

2.320例急乙肝恢复患者pDC频数、CD86+pDC频数以及功能分子表达,CD4+T细胞频数,Th1、Th2亚群细胞频数及Th2/Th1比值在入组的31例急乙肝患者中20例在24周时恢复，急乙肝恢复期CD86+pDC频数显著高于急性炎症期CD86+pDC频数(表3)，而pDC频数和CD86MFI在急乙肝恢复前后差异无统计学意义(表3)。然而，对于辅助性CD4+T细胞在急乙肝恢复前后虽然没有统计学差异(表3)，但是由图1中可以看出在急乙肝恢复前后CD4+T、Th2、Th1频数及 Th2/Th1比值存在变化趋势：CD4+T、Th2频数在急乙肝恢复后有下降趋势(图1 A,1B)，而Th1频数则呈上升趋势(图1C)，Th2/Th1比值降低(图1D)。

2.4临床指标(ALT、HBeAg、HBsAg和HBVDNA)与pDC、辅助性T细胞及功能分子的相关性

在AHB组，HBV DNA与ALT(r=0.450,P=0.006)、Th2频数(r=0.304,P=0.048)呈正相关；而在IA组HBV DNA、HBsAg、HBeAg与ALT、pDC频数、CD86+pDC频数、CD86MFI、CD4+T细胞频数、Th2频数、Th1频数及Th2/Th1均无相关性。

3 讨论

pDCs 通过TLR9 识别病毒，依赖MyDD88 信号途径，激活IRF7 和NF-κB，从而分泌大量I 型IFN及多种炎性细胞因子，如TNF-α、IL-12 和IL-6。I 型IFN 不仅能直接抑制病毒复制，而且能增强NK 细胞介导的细胞毒和IFN-γ生成，辅助性CD4+Th 细胞的分化，CD8+T 细胞细胞毒活性和IFN-γ的分泌[4-5]。

不同的HBV感染状态，有着不同的免疫应答结果和临床转归；HBV感染中，pDCs在固有免疫应答早期抗病毒中发挥重要作用， CD4+T细胞在适应性免疫应答中对清除病毒感染起关键作用。本研究结果显示，慢性感染者中具有刺激作用的CD86+pDC频数及功能分子CD86表达显著高于急性感染者，而CD4+T细胞频数显著低于急性感染者，也就是说，在慢性HBV感染早期，固有免疫中的pDC细胞发挥主导作用，适应性免疫的CD4+T细胞免疫应答减弱，而急性HBV感染早期，非特异性免疫应答较弱，随着感染进展，病毒复制增加，体内迅速诱发针对HBV感染的强烈的特异性细胞免疫应答，辅助性CD4+T细胞免疫增强[7,11]，在清除病毒中起主导作用。

急性HBV感染者大多数可发生自限性恢复。本研究显示，急性乙型肝炎恢复后具有刺激功能的CD86+pDC频数显著增加；先前研究表明，病毒及其蛋白抑制pDC功能[12-13]，感染恢复后，病毒及其蛋白显著下降，对pDC功能的抑制作用减弱，使得具有刺激功能的CD86+pDC频数增加，pDC功能有所恢复。本研究还发现，CD4+T、Th2频数在急乙肝恢复后呈现下降趋势，而Th1频数则呈现上升趋势，Th2/Th1比值降低，在急性乙型肝炎感染期，Th2型细胞占主导作用，而在感染恢复期，Th1型细胞占主导地位。急性HBV感染恢复过程中，随着ALT水平的增加，为了避免免疫应答对肝脏的过度损伤，机体内的负反馈调节机制致使特异性的细胞免疫应答CD4+T细胞免疫被抑制[14]，因此CD4+T频数有下降趋势。Th2型细胞主要通过调节体液免疫，并分泌促炎症细胞因子，参与肝脏的炎症损伤过程[15-16]，急性感染恢复后，Th2型细胞频数呈现下降趋势，炎症损伤受到抑制；有研究显示，Th1型细胞主要通过释放多种细胞因子如IL-2、IFN-γ，调节CTL细胞的细胞毒作用，介导细胞免疫应答，有利于自身病毒的清除[17]，在急性感染恢复期，Th1型细胞频数呈现上升趋势，在恢复期发挥主导作用，促进病毒感染的彻底清除。

有研究证实，急性乙型肝炎感染期，随着病毒快速复制，激发CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞免疫应答作用，诱发明显的肝脏炎症损伤，致使大量病毒感染肝细胞受损，释放出大量的ALT[18]，研究结果：在AHB组，HBV DNA与ALT、Th2频数呈正相关也证实了这一观点。

总之，pDC、辅助性CD4+T细胞频数及功能的变化在HBV感染的不同状态及临床转归中发挥重要的作用，深入了解pDC、辅助性CD4+T细胞在急慢性HBV感染中的作用有助于为治疗HBV感染提供新策略。

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