2016年盐城地区麻疹病毒分子分型及血凝素蛋白基因特征分析

陈国清 李春香 王瑶 李峰 徐士林 李长城 邵荣标

224001 盐城市疾病预防控制中心(陈国清、王瑶、李峰、徐士林、李长城、邵荣标)；224002 盐城市妇幼保健院(李春香)陈国清、李春香对本文同等贡献

麻疹是由麻疹病毒(Measles, MV)引起的全球性急性病毒性传染病，被感染者以发热、出疹、呼吸道卡他症状为主要临床特征，特别是5岁以下婴幼儿感染后容易引起肺炎、包涵体脑炎、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)等并发症和后遗症[1-2]。麻疹病毒为有包膜单股负链不分节段RNA病毒，其中编码的核蛋白(Nucleoprotein, N)和血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)基因变异最大，根据N基因羧基末端450核苷酸序列特征，全球流行或者曾经流行的麻疹病毒分为8个基因组，24个基因群[3-5]。目前，人群感染的麻疹病毒来源主要有各区域本土优势流行循环野毒株、输入性野毒株以及疫苗相关株，局部地区时有麻疹的暴发流行。自将麻疹疫苗纳入免疫规划以后，中国的麻疹报告发病率和死亡人数大幅降低，但各地麻疹报告发病率时有反复，为了解盐城地区麻疹病毒基因型流行特征以及溯源麻疹病毒进化路径，对2016年盐城地区流行的麻疹病毒进行基因型分型及对其HA基因进行分子进化特征分析，从分子水平上掌握麻疹病毒的基因变异与流行的关系，从基因层面探讨现用疫苗的保护效果，为盐城市防控麻疹病毒的流行提供科学依据。

1 材料与方法

1.1标本来源由各县市区医疗机构以及各疾控机构按照麻疹监测方案要求，采集2016年盐城市各县市区疑似麻疹病例咽拭子，诊断标准参照2014版《全国麻疹监测方案》，采集的标本在冷藏条件下48 h内送到市疾控中心麻风疹分子网络实验室。

1.2方法

1.2.1 核酸提取和荧光RT-PCR检测：用Qiagen公司QiaAmp Viral RNA Mini Kit(Cat No：52904)提取疑似麻疹病例RNA。采用麻疹、风疹双通道实时荧光RT-PCR核酸检测试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)，筛选出麻疹病毒核酸阳性样本。实验过程质量控制以及结果判断严格参照试剂盒说明书。

1.2.2 麻疹病毒核蛋白基因核苷酸序列RT-PCR扩增：以麻疹病毒核酸阳性的标本为模板，采用TaKaRa公司one step RT-PCR Kit和全式金生物公司2×EasyTaq PCR SuperMix Kit试剂盒，通过自设的引物对麻疹病毒核蛋白羧基末端450个核苷酸序列进行巢式PCR扩增，第1轮进行RT-PCR扩增，引物序列为F1：5′-TATCMACACTTGARTCCYTG-3′，R：5′-TGTGGACYTGGWTCCTAAG-3′，参照试剂盒说明书配置反应体系50 μl，其中模板RNA 2 μl。扩增条件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min；取第1 轮扩增产物2 μl为模板，内侧引物序列为F2：5′-GGAGCTATGCMATGGGAGT-3′，R：5′-TGTGGACYT GGWTCCTAAG-3′，进行第2 轮PCR，参照试剂盒说明书配置反应体系50 μl。扩增条件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min，长度660 bp，PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳确认。

1.2.3 麻疹病毒血凝素蛋白基因全长编码区核苷酸序列扩增：运用自设的引物对麻疹病毒血凝素蛋白基因全长编码区序列进行巢式PCR扩增，PCR试剂盒为上述两种。第1轮进行RT-PCR扩增，引物序列为F1：5′-GTTGGYATGTCAAGRCCAGG-3′，R：5′-GGTTRACRGAYAGCGAGTCC-3′，扩增条件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，共30个循环，72 ℃ 10 min；取第1 轮扩增产物2 μl为模板，F2：5′-CTTAGGRTGCAAG AYCATCC-3′，R：5′-GGTTRACRGAYAGCGAGTCC-3′，作为内侧引物进行第2 轮PCR，扩增条件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 10 min，长度2 008 bp，体系配置参照上述反应。PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳确认。

1.2.4 麻疹病毒核蛋白基因、血凝素蛋白基因序列测定与分析：将电泳后具有单一目的条带核蛋白基因(660 bp)、血凝素蛋白基因(2 008 bp)PCR未纯化产物送上海生工公司进行测通，经拼接的序列Blast比对，确认麻疹病毒核蛋白基因和血凝素蛋白基因。从GenBank数据库选取近年国内外麻疹病毒参考株(包括24个基因型的代表株)、 中国疫苗株沪S191序列等，使用DNAStar中MegAlign软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析，mafft方法进行核苷酸序列比对分析，采用MEGA6.0软件相邻连接法(Neighbor-Joining method)构建亲缘关系进化树，Bootstrap值取1 000进行可靠性评估。

2 结果

2.12016年盐城地区麻疹病毒核蛋白基因、血凝素蛋白基因RT-PCR盐城市2016年1～5月共采集45例疑似麻疹患者咽拭子标本，经实时荧光RT-PCR检测，共获得26例麻疹病毒核酸阳性，阳性率57.78%(26/45)。按1～5流行月分别随机选取1株、2株、3株、5株、5株麻疹病毒核酸阳性共16株标本，进行N基因、HA基因RT-PCR巢式扩增，分别获得15株N基因条带(660 bp)，14株HA基因条带(2 008 bp)，与预期结果一致。

2.22016年盐城地区流行的麻疹病毒基因型分子分型按1～5流行月随机选取盐城市2016年麻疹病毒核酸阳性标本共16株，对麻疹病毒N基因羧基末端450 bp核苷酸进行巢式扩增、纯化、测序，获得15株有效序列与GenBank数据库中24个基因型代表株构建系统进化树，进行基因型的分析。根据序列亲缘关系进化分析显示：5株为H1a基因亚型，10株为D8基因型。见图1。

● 表示2016年盐城地区麻疹病毒代表株；▲表示中国疫苗株沪S191图1 盐城2016年麻疹病毒代表株核蛋白基因羧基末端450个核苷酸序列与各基因型参考株序列系统进化树● Strains of measles viruses in Yancheng area in 2016; ▲ Chinese vaccine of Shanghai S191Fig.1 Phylogenetic tree of the N gene sequences of 450 nucleotide of C-terminal of measles viruses in Yancheng area in 2016 and different genotypes reference strains of measles viruses

2.3盐城地区不同基因型麻疹病毒N基因和HA基因核苷酸和氨基酸同源性分析随机选取的16株麻疹病毒核酸阳性的咽拭子标本，经巢式PCR扩增N基因(羧基末端450 bp片段)和H基因(全长编码区1 854 bp片段)，扩增产物经纯化、测序，分别获得15株N基因序列和12株HA基因序列，获得序列都没有核苷酸的插入或者缺失。15株N基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7%～100%和90.0%～100%。其中，5株H1a亚型毒株N基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%～100%和100%，10株D8基因型毒株N基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%～100%和98.7%～100%。12株HA基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为93.2%～100%和94.1%～100%。其中，5株H1a亚型毒株HA基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%～99.9%和99.5%～100%，7株D8基因型毒株HA基因序列组内核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%～100%和99.7%～100%。H1a基因亚型与D8基因型盐城代表株N基因、HA基因与各参考株核苷酸、氨基酸同源性见表1。

2.4盐城地区不同基因型麻疹病毒HA基因全长编码区核苷酸序列系统进化分析5株H1a亚型和7株D8基因型盐城代表株HA基因全长编码区1 854 bp核苷酸序列分别与GenBank数据库中选取的近年国内外相应基因型参考株构建HA基因系统进化树，以疫苗株沪S191为组外对照。系统进化树表明：国内主流的H1a基因亚型的毒株根据聚类毒株流行的时间关系分为H1a-1和H1a-2两大基因群的进化分支。其中，盐城地区5株H1a代表株与江西代表株(KJ136545)聚类成独立的进化小分支，与湖北代表株(KM385536、KM385535)、山东代表株(JN997514、JN997503)、青海代表株(JN997501)以及安徽代表株(JN997518)亲缘关系相近，在同一个进化谱系中，属H1a-1进化基因群分支；D8基因型毒株根据聚类毒株的亲缘关系分为3个进化分支，分别为D8-1、D8-2、D8-3。1998年加拿大代表株(AF410985)单独聚成D8-1进化分支，7株盐城代表株与2009年美国代表株(JN635404)聚集成簇，与1994年英国代表株(U29285)亲缘关系相近，聚成D8-3分支中D8-3-2小分支基因群毒株，逐渐远离D8-1、D8-2进化分支基因群的毒株。见图2。

表1 盐城市2016年麻疹病毒代表株N基因、HA基因与各参考株核苷酸和氨基酸同源性分析

● 表示2016年盐城地区H1a基因亚型麻疹病毒代表株；▲表示2016年盐城地区D8基因型麻疹病毒代表株图2 盐城2016年H1a基因亚型(A)、D8基因型(B)麻疹病毒HA基因全长编码区核苷酸序列系统进化树●Subgenotype H1a strains of measles viruses inYancheng area in 2016; ▲Genotype D8 strains of measles viruses inYancheng area in 2016Fig.2 Phylogenetic tree of the complete HA gene sequences of subgenotype H1a(A) and genotype D8(B)strains of measles viruses in Yancheng area in 2016

2.5盐城地区不同基因型麻疹病毒HA基因全长编码区氨基酸位点变异分析2016年盐城地区12株麻疹病毒代表株相对于疫苗株沪S191(U03663)共涉及43个氨基酸位点的变异，变异率为6.97%(43/617)，其中，5株H1a基因亚型毒株共涉及31个氨基酸位点的变异，变异率为5.02%(31/617)，7株D8基因亚型毒株共涉及18个氨基酸位点的变异，变异率为2.92%(18/617)。麻疹沪S191疫苗株HA基因编码蛋白5个N-糖基化位点分别涉及168、187、200、215、238五个氨基酸位点，416位N-糖基化位点存在少数毒株中[6]，氨基酸序列分析发现，盐城地区5株H1a代表株与疫苗株沪S191相比240位氨基酸发生了S240 N的变异，丢失了238位N-连接的糖基化位点，7株D8基因型代表株未发生N-糖基化位点的变化。与线性血凝素蛋白抗原表位(linear hemagglutinin noose epitope, HNE)相关的第397位点[7]，5株H1a基因亚型的毒株发生了P397 L位点的变异，7株D8基因型毒株397位点未发生变异。麻疹病毒HA基因编码氨基酸的B细胞抗原表位主要位于236～250位点上[8]，除5株H1a代表株240位氨基酸位点发生变异外，12株麻疹病毒代表株均未发生B细胞抗原表位氨基酸位点的变异。见表2。

3 讨论

通过此次研究，发现2016年盐城地区主要有H1a基因亚型、D8基因型两种型别的毒株流行。据1993年许文波等[9]研究，中国当时流行的麻疹病毒主要以H1基因型为主，分为H1a、H1b、H1c三个基因亚型。近年，H1a基因亚型麻疹毒株成为中国本土绝对优势流行循环毒株[10-11]。2016年盐城地区流行的H1a基因亚型毒株正是国内主流优势循环株。

系统进化分析表明：H1a基因亚型的毒株在中国本土的流行具有明显的时空进化迁徙特征，H1a-2进化分支的毒株流行于2003-2013年，分布于上海、江西、海南、河北、江苏、浙江、贵州等地，2013年后，该基因群的毒株较为少见，H1a-1进化分支的毒株流行于2005-2016年，流行于青海、安徽、山东、湖北、江西等地，该分支基因群的毒株为优势进化分支，盐城5株H1a基因亚型毒株聚集成簇，形成众多分支，具有不同的传播支链，与2012年江西代表株(KJ136545)形成独立的进化分支，共享一条传播主链。盐城7株D8基因型毒株与2009年美国代表株(JN635404)聚集成簇，形成独立的进化分支，共享一个传播主链，同英国代表株(U29285)在一个进化分支中，与加拿大代表株(KF591391、KJ018971)、德国代表株(JQ417681、FJ808738)、英国代表株(KT732232、KT732261)、印度代表株(FJ719489、FJ387143)、越南代表株(KU728743)、美国代表株(JN635407)等亲缘关系较远，推测盐城流行的D8基因型毒株可能来源于美国。经现场流行病学调查，盐城各县市区采集的疑似麻疹病例都是散发病例，病例之间没有流行病学关联，因2016年以前盐城地区从未在分子水平上开展过麻疹病毒基因特征的分析，本地流行的麻疹病毒基因型别背景不清晰，经本研究结果推断：输入性D8基因型麻疹毒株已经导致本地广泛流行，流行的强度可能高于H1a基因亚型。D8基因型毒株地理分布广泛，过去印度等东南亚国家为主要流行区，自2012年上海发现中国首例输入性D8基因型毒株后，其他省份如湖北、北京和广东等地也发现有D8基因型毒株的流行[12-15]，这种输入性D8基因型毒株在中国的流行值得关注，是否会成为中国优势流行基因型毒株，还要通过长期的监测数据来分析。

对2016年盐城地区12株麻疹病毒HA基因编码氨基酸序列分析发现：相对于疫苗株沪S191，盐城地区5株H1a代表株240位氨基酸位点发生了S→N的变异，由此丢失了238位N-连接的糖基化位点，因糖基化位点影响到麻疹病毒血凝素蛋白抗原性以及空间结构的折叠，可能会影响H1a基因亚型麻疹病毒免疫原性发生变化，7株D8基因型代表株未发生N-糖基化位点的变化。与线性血凝素蛋白抗原表位相关的第397位点，5株H1a基因亚型的毒株为Leu，不同于疫苗株，导致一个潜在的血凝素抗原表位的丢失；7株D8基因型毒株397位点未发生变异。麻疹病毒HA编码的617个氨基酸包含13个半胱氨酸残基，其中第287、300、381、394、494、579、583位点[14]7个位点与抗原结构和细胞内加工有关，盐城地区12株麻疹病毒HA蛋白分子上与抗原结构相关的7个半胱氨酸位点未发生变化，B细胞抗原决定簇第236～250氨基酸位点非常保守，除5株H1a代表株240位氨基酸位点发生变异外，12株麻疹病毒代表株均未发生B细胞抗原表位氨基酸位点的变异。从对麻疹病毒HA基因和氨基酸序列研究的分子水平看，5株H1a基因亚型麻疹代表株要比7株D8基因型代表株变异度活跃，但总体来看，盐城地区麻疹病毒HA蛋白氨基酸变异程度对病毒本身抗原性和免疫原性影响不大。

综上所述，2016年盐城地区有两种基因型麻疹野毒株的流行，分别为我国H1a优势基因亚型和D8输入性基因型野毒株，麻疹病毒HA基因一直处于非抗原决定簇氨基酸位点点突变的抗原漂移积累变化中。从麻疹病毒HA基因的核苷酸和氨基酸的分子水平分析，现有疫苗株沪S191对盐城地区两种基因型别的麻疹野毒株仍具有保护力，今后要不断加强麻疹病毒HA基因分子变异的动态监测，了解基因变异对抗原的影响，高度重视D8输入性基因型毒株在盐城地区的流行。

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