14岁以下儿童抗耶氏肺孢子菌合成抗原IgG和IgM抗体的调查

乌姗娜 郭爽 靳庆娥 田小军 李威 栗绍刚 任翊 王刚

100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院检验科(乌姗娜、靳庆娥、王刚)；100050 北京， 首都医科大学附属北京友谊医院 北京热带医学研究所 热带病防治研究北京市重点实验室(郭爽、田小军、李威、栗绍刚、任翊)乌珊娜、郭爽为对本文同等贡献

耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii，Pj)是肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)的病原体，是免疫缺陷患者重要的致死原因[1-2]。Pj的主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein，Msg)是Pj表达量最大的分泌蛋白，是Pj与宿主免疫相互作用的重要抗原，其诱导宿主产生的特异性抗体，不仅是人群感染Pj的血清学证据，也是宿主清除Pj的重要手段[3]。Pj仅感染人类在人群中普遍存在，出生后人群感染Pj的流行病学情况认识很少。

本研究利用重组主要表面抗原(Recombinant Msg，rMsg)，建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，对北京地区14岁以下随机人群201例血清标本，进行抗Pj rMsg IgG和IgM抗体检出情况的调查，从而确定其是否感染过及正在感染肺孢子菌。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 主要试剂：谷胱甘肽Sepharose(Novagen)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(北京中杉金桥)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgM抗体(上海生工生物)，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 标本来源：(1)Pj rMsg表达载体由北京市热带医学研究所制备[4]。

(2)14岁以下人群血清随机收集自2015年5月5日至2015年10月14日期间，血清来自首都医科大学附属北京友谊医院检验科病毒室进行巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、弓形体、风疹病毒IgM抗体检测项目样本。共201份血清入组，每份样本其病例临床信息资料完整，本研究得到首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会批准通过。

1.2方法

1.2.1 人群阴性对照血清的制备：将纯化后的可溶Pj rMsg原核表达抗原按100 μg/cm2的量滴在硝酸纤维(Nitrocellulose，NC)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后用PBS清洗膜，将抗原标记的NC膜分别放入20例随机血清中，室温孵育1 h后，取出NC膜丢弃，按上述方法4 ℃过夜第二次吸附，使血清中可能存在的抗Pj rMsg抗体完全吸附掉，制备成阴性对照血清。将阴性标准血清按1∶100稀释，稀释液为0.05%PBST含有5%脱脂奶粉和5%(v/v)pGEX-3X 质粒转化大肠埃希菌Rosetta在同样条件下诱导后获得的可溶蛋白。Pj rMsg抗原酶标板包被量为0.2 μg/孔，4 ℃过夜。设空白对照，TMB显色15 min，2 mol/L H2SO4终止后用酶标仪(Synergy H1)检测，用450 nm/630 nm双波长检测。样本OD值=样本(OD450-OD630)-[空白(OD450-OD630)]。计算20例阴性标准血清OD值的分布情况。20份阴性标准血清混合后分装保存，作为阴性对照。预实验中选取OD值最高的血清2份分装保存，作为阳性对照。

1.2.2 人群血清ELISA试验: 用1.2.1中稀释液按照1∶100稀释样本血清，抗体稀释浓度分别为辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体1∶2 000，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgM抗体1∶10 000。用1.2.1中建立的阴性和阳性对照进行样本血清抗体筛选，每次ELISA试验均设空白对照、阴性对照和阳性对照，当阴性对照OD值小于通过阴性标准血清判定的阈值(Cutoff值)，阳性对照OD值大于阈值时认为本次试验有效。

1.3统计学方法采用SPSS16.0软件对数据进行统计学处理，正态分布采用K-S检验(Kolmogorov-Smirnov)，计数资料采用χ2检验，P<0.01认为差异有统计学显著性意义。

2 结果

2.1调查人群的人口学特征在201名14岁以下的人群中，女性106例(52.7%)。按出生年龄分成3组，其中出生日龄1～30 d组78例(38.8%)，4.45 d±5.70 d(1～26 d)；出生1～12月龄组33例(16.4%)，4.09 m±3.19 m(1～10 m)；出生年龄1岁～14岁组90例(44.8%)，4.16岁±3.05岁(1～14岁)。按临床诊断分为肺炎组76例(37.8%)，非肺炎组125例(62.2%)。

2.2ELISA调查人群抗PjrMsgIgG抗体20例阴性标准血清测得IgG抗体OD值0.010±0.007，正态分布K-S检验(Ζ=1.000，P=0.270)，呈正态分布。IgG抗体数值的阈值按均值+2×标准差计算，以OD值>0.024定义为阳性。 按照上述标准，201例入组人群血清抗Pj rMsg IgG抗体阳性率为25.9%(52/201)，其中男性阳性率为25.3%(24/95)，女性阳性率为26.4%(28/106)，两组比较差异无统计学意义(χ2=0.035，P=0.852)。不同年龄组的阳性率分别为：1 d～30 d年龄组10.3%(8/78)，1～12月龄年龄组21.2%(7/33)，1岁～14岁组41.1%(37/90)，组间比较差异有统计学意义(χ2=21.190，P=0.000)，见图1。

注：*每个年龄组的anti-Pj rMsg IgM的阳性率(%)图1 抗Pj rMsg IgM阳性人群年龄分布Note: * Anti-Pj rMsg IgM positivity in each age groupFig.1 Age distribution of anti-Pj rMsg IgM antibody positive cases

2.3ELISA调查人群抗PjrMsgIgM抗体20例阴性标准血清测得IgM抗体的OD值为0.007±0.006，正态分布K-S检验(Ζ=1.190，P=0.118)显示其OD值呈正态分布。IgM抗体数值的阈值按均值+2×标准差计算，以OD值>0.019定义为阳性。 201例人群血清抗Pj rMsg IgM抗体阳性率为43.3%(87/201)，其中男性阳性率为42.1%(40/95)，女性阳性率为44.3%(47/106)，两组比较差异无统计学意义(χ2=0.102，P=0.750)。不同年龄组中IgM抗体阳性率分别为：1 d～30 d年龄组6.4%(5/78)，1～12月龄年龄组39.4%(13/33)，1岁～14岁组76.7%(69/90)，组间比较差异有统计学意义(χ2=84.260，P=0.000)。肺炎组阳性率59.2%(45/76)，非肺炎组阳性率33.6%(42/125)，两组比较差异有统计学意义(χ2=12.628，P=0.000)。

2.4ELISA调查人群抗PjrMsgIgG和IgM抗体同时检出情况入组人群血清抗Pj rMsg IgG和IgM抗体同时检出情况见表1，该人群暴露Pj后的抗Pj rMsg IgG或IgM抗体总体检出阳性率高达46.8%。肺炎组抗Pj rMsg IgG或IgM抗体阳性率65.8%(50/76)，非肺炎组阳性率35.2%(44/125)，两组比较差异有统计学意义(χ2=17.764，P=0.000)。

表1 抗PjMsg IgG和IgM抗体筛查结果Tab.1 Results of screening for anti-Pj Msg IgG and IgM antibodies

3 讨论

Pj广泛存在于人群中[5]，免疫功能健全的个体暴露后可通过先天免疫和适应性免疫及时清除吸入的Pj[6]，但免疫功能低下个体可以出现PCP，随着免疫治疗的广泛应用，有报道在使用环磷酰胺[7]、利妥昔单抗[8]和依那西普[9]后出现PCP，所以PCP是临床各个科室都可能见到的临床问题，而对于它的自然感染过程相关流行病学资料有限。本研究用rMsg为抗原蛋白建立ELISA方法，进而分析Pj抗体。既往研究中Daly KR等[10]用原核细胞表达了三段Msg合成抗原，Msg A、Msg B和Msg C，均为利用6个组氨酸纯化的包涵体抗原。其中MsgA(氨基酸8-123)与本研究使用的Pj rMsg(氨基酸2-114)部分重叠，连续8个氨基酸一致的部分有2段，一致率60%(70/116)。国外流行病学调查表明，健康儿童在12月龄时抗MsgA IgG抗体出现峰值，在10月龄时抗MsgC IgG抗体出现峰值[11]，成人时抗Pj IgG抗体阳性率85%[12]。本研究中抗Pj rMsg IgG和IgM抗体阳性率均随着年龄增加而增加。研究显示Pj IgM抗体一般在感染后2～4周出现，1 d～30 d年龄组抗Pj rMsg IgM检出率为2.6%(2/78)，到1～12月龄年龄组增加至39.4%，说明个体出生后呼吸系统暴露Pj并产生免疫应答，IgM抗体阳性率随即不断增高，到1岁～14岁时增至76.7%，到成人后阳性率开始下降：20～29岁年龄组 32.9%(28/85)、30岁～ 39岁年龄组27.6%(24/87)，到40岁～50岁年龄组阳性率再次上升到62.8%(59/94)[13]，呈现1岁～14岁和40岁～50岁两个年龄组检出率高的双峰现象，推测年幼与年长人群需要启动体液免疫清除Pj，而健康成人随时暴露随时清除，不需要启动特异性体液免疫有关。

关于Pj对于儿童呼吸系统致病性的观察结论有争议，Rivero L[14]报道了1例6月龄婴儿感染PCP家庭成员调查情况，采用Pj线粒体大亚基rRNA(Mitochondrial large subunit rRNA，mtLSUrRNA)做为靶基因进行巢氏PCR，结果父母及婴儿兄长均为阴性，祖父母为阳性而且祖父的Pj mtLSUrRNA基因型与婴儿一致，作者推测患儿PCP由祖父传染导致。但是Vargas等[15]调查了圣地亚哥1999—2004年128例猝死婴儿(平均年龄101 d)，利用Pj mtLSUrRNA作为靶基因进行巢氏PCR，并进行免疫荧光显微镜检查(immunofluorescence microscopy，IF)，结果82.0%(105/128)Pj 巢氏PCR阳性，3-4月龄组病例中阳性率最高(97.6%，40/41)，113例死亡原因不明组和15例死亡病因明确组比较，Pj检出率差异无统计学意义(84.0% vs. 66.7%，P=0.28)，作者认为Pj与婴儿猝死无关。虽然本研究中抗Pj rMsg IgM阳性率肺炎组(59.2%)高于非肺炎组(33.6%)，但研究为回顾性研究、肺炎诊断为临床诊断，没有前瞻性研究中严格的肺炎定义和影像学证据，所以结果不能明确支持Pj在14岁以下人群肺炎中的致病意义。

结论：北京地区14岁以下人群抗Pj rMsg IgG或IgM抗体总体检出阳性率为46.8%，阳性率随着出生后年龄的增加而逐渐增加。

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