银杏叶聚戊烯醇纳米乳液联合抗生素抗菌活性研究
2017-03-08王成章叶建中陈虹霞
陶 冉， 王成章*， 叶建中， 周 昊， 陈虹霞
(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091；2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042)
银杏叶聚戊烯醇纳米乳液联合抗生素抗菌活性研究
TAO Ran
陶 冉1,2， 王成章1,2*， 叶建中2， 周 昊1,2， 陈虹霞2
(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091；2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042)
通过探讨银杏叶聚戊烯醇纳米乳液(GBP)的平均粒径对其自身抗菌增效作用的影响，以及考察最小抑菌浓度(MIC)和分级抑菌浓度(FIC)；同时研究亚抑菌浓度条件下，聚戊烯醇纳米乳液与抗生素联合作用的时间-杀菌曲线，研究了银杏叶聚戊烯醇纳米乳液与氨苄西林(A)、环丙沙星(C)、硫酸庆大霉素(G)、红霉素(E)和多粘菌素B硫酸盐(P)这5种抗生素的协同抗菌作用。结果显示：聚戊烯醇乳液配伍抗生素的抑菌圈直径随着乳液平均粒径增大而减小，由此推断聚戊烯醇纳米乳液可能具有提高聚戊烯醇自身的增效能力。聚戊烯醇纳米乳液与硫酸庆大霉素混合对金黄色葡萄球菌具有协同抗菌作用(FIC指数为0.5)，混合样抑菌圈值为(25.8±0.1)mm， MIC值为33 mg/L。聚戊烯醇与硫酸庆大霉素混合可以有效地提高对金黄色葡萄球菌的抗菌效果并延长抗菌时间。
银杏；聚戊烯醇；纳米乳液；抗生素；抗菌作用
抗生素的不规范使用甚至滥用，已成为中国乃至国际医疗、食品安全管理中最为关注的问题。抗生素的滥用导致的微生物耐药性以及其本身的毒副作用，在不知不觉中威胁着人类生命健康。因此，在科学用药的前提下，寻找更强抗生素的同时，能够筛选出天然高效、具有广泛抗菌增效作用以及延长抗菌时效的化合物，是缓解此类问题较为有效的途径。聚戊烯醇是由若干个异戊烯基单元及终端异戊烯羟基组成的线性长链同系物，是生物体细胞膜糖蛋白生物合成的关键产物，以游离态醇或磷酸酯形式分布于细胞膜中，并能够参与生物体内多种生理代谢活动[1-2]。目前已有报道的聚戊烯醇及其衍生物已有几十种，生物活性主要包括抗癌、抗病毒、改善大脑功能、保肝以及抗菌等作用[3-6]。聚戊烯醇广泛存在于高等植物中，银杏叶和绿色针叶中的聚戊烯醇含量相对较高，银杏叶中含聚戊烯醇达2.0%，碳链分布范围在C70～C120[7]。利用聚戊烯醇作为良好的生物细胞膜调节剂辅助抗菌药物进入细胞内部参与代谢，可以较好地提高药物的生物利用度以及靶向性，从而达到减少抗生素用量和提高抗菌治疗效果的目的。然而，聚戊烯醇的强疏水性导致其在水中不能良好分散，影响其生物活性研究以及相关制剂开发。利用乳化剂复配及纳米分散技术制备聚戊烯醇水包油型纳米乳液可以有效达到聚戊烯醇在水中良好分散的目的[8]。为了研究银杏叶聚戊烯醇纳米分散后的抗菌协同作用，本研究选择5种化学结构类型不同、作用机理不同且较为明确的抗生素(氨苄西林、环丙沙星、硫酸庆大霉素、红霉素和多粘菌素B硫酸盐)作为抗菌剂，考察聚戊烯醇纳米乳液的平均粒径对其自身抗菌增效作用的影响，进而通过比较最小抑菌浓度(MIC)和分级抑菌浓度(FIC)来考察聚戊烯醇纳米乳液的抗菌增效作用；进一步分析了亚抑菌浓度条件下，聚戊烯醇纳米乳液与抗生素联合作用的时间杀菌曲线。
1 实 验
1.1 材料与仪器
银杏叶聚戊烯醇(C70～C120)，按文献[6]方法制备(波长210 nm，HPLC面积归一法测得纯度>99.0%)[9]。供试菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli)NCTC 12923、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923，中国典型培养物保藏中心。柱层析用硅胶G(40～45 μm)，试剂级；薄层析用硅胶G，分析纯；硫酸庆大霉素(Sigma G3632, 100 mg)；牛肉膏、鱼粉蛋白胨、卵磷脂、琼脂条等，均为生物试剂，其他试剂为分析纯或色谱纯。
ZLE-B300型均质乳化机，上海众时机械有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，SPD-20A型(DAD)检测器，日本岛津；LDZX-50KBS高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SPX-250生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-1G净化工作台，苏州净化设备有限公司；CASBA- 4 菌落扫描仪及软件，美国Spiral Biotech公司。
1.2 实验方法
1.2.1 纳米乳液的制备 称取银杏叶聚戊烯醇10 g(约8.3 mmol)于250 mL锥形瓶中，边搅拌边加入17.5 g乳化剂(m(Span 80) ∶m(Tween 80) 0.514 ∶0.486，HLB值9.5)，充分搅拌后，缓慢加入少量去离子水，充分混合后继续加水转相至100 mL，充分搅拌后，通过调整温度、搅拌速度以及时间，得到质量浓度均为500 mg/L的不同粒径聚戊烯醇纳米乳液GBP-1、GBP-2、GBP-3和GBP- 4,平均粒径分别为90.2、289.7、632.9和11 012.2 nm[8]。
1.2.2 抑菌活性测定 采用牛津杯检测法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了抑菌试验[10]。将500 mg/L纳米乳液并滴加到牛津杯中，按相等间距分别放置在琼脂表面上，在37 ℃下培养24 h。每个浓度相同的样品重复测定3次。以氨苄西林(A)、硫酸庆大霉素(G)、环丙沙星(C)、红霉素(E)和多粘菌素B硫酸盐(P)等5种抗生素作为阳性对照，质量浓度分别为10 mg/L氨苄西林，10 mg/L环丙沙星，10 mg/L 硫酸庆大霉素，15 mg/L红霉素，10 mg/L 多粘菌素B硫酸盐，以空白(只有水和乳化剂，不含样品和抗生素)作为阴性对照。培养24 h后，观察抑菌圈直径(mm，包含杯的外边)。混合样品各终浓度与单一样品浓度保持一致，即为10 mg/L氨苄西林+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L环丙沙星+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L硫酸庆大霉素+500 mg/L聚戊烯醇，15 mg/L红霉素+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L多粘菌素B硫酸盐+500 mg/L聚戊烯醇。所有试验样品均含3个平行样，用标准误(SEM)来表示抑菌圈直径的误差。
1.2.3 最小抑菌质量浓度的测定 利用肉汤稀释法测定最小抑菌质量浓度(MIC)。样品质量浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1和0.5 mg/L，按文献[11]方法在37 ℃培养24 h后，培养皿显示没有明显的菌株生长的浓度即为MIC。
1.2.4 分级抑菌浓度的测定及抗菌协同作用类型的确定 A和B联合用药的分级抑菌浓度(FIC)指数是其单独用药时与两种药物联合用药时MIC比值的总和。抗菌协同作用类型的确定：0
1.2.5 对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线 研究在亚抑菌质量浓度下(硫酸庆大霉素2 mg/L，聚戊烯醇 64 mg/L 及其混合样品中含有0.5 mg/L硫酸庆大霉素和16 mg/L聚戊烯醇)样品对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线[13]。用预热的阳离子调节肉汤(CA-MHB)稀释菌液30倍后隔离培养过夜，然后在37 ℃ 进一步培养直至对数生长期晚期，用CA-MHB稀释好的菌液在630 nm处测定吸光度。每个瓶中的菌液浓度为109个/mL，在摇床中37 ℃下振荡培养24 h，前12 h中，样品每2 h取样一次，之后在18和24 h各取样一次。细菌总数通过稀释10倍的样品(50 μL)转移到米勒-海顿琼脂(MHA)板来确认。在加湿的孵化器中孵化(37 ℃)18至24 h，每个样品中的细菌密度由CASBA- 4菌落扫描仪相关软件确定。
2 结果与分析
2.1 抑菌活性及协同作用的确定
将4种不同粒径的聚戊烯醇乳液(GBP-1、GBP-2、GBP-3和GBP- 4)分别与5种抗生素按1.2.2节终浓度混合，通过抑菌圈直径大小的比较考察其抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性，并通过方差(Tukey检验在5%的概率)进行分析，结果见1。
表1 抑菌圈直径比较Table 1 The diameters of the inhibition halos
1)*:比抗生素组抑菌圈值大且有统计学差异greater and having statistical difference compared with the corresponding antibiotics group (Tukey 检验Tukey′s HSD test,p<0.05)，同组同一列不同小写字母(a, b, c, d)表示有统计学差异the different lowercase letters (a,b,c,d) in the column of the same group indicate statistical difference (Tukey 检验Tukey′s HSD test,p<0.05)
由表1结果显示，银杏叶聚戊烯醇纳米乳液除了与氨苄西林(A)、多粘菌素B硫酸盐(P)配伍对大肠杆菌无协同作用外，其它配伍对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的协同抑制作用，即单抗生素抑菌圈由8.9～26.8 mm上升至配伍后抑菌圈11.6～29.5 mm(阴性对照为0)。GBP-1配伍组抑菌性能增强最多，其次是GBP-2和GBP-3，GBP- 4最弱。可以看出，聚戊烯醇乳液协同抑菌活性随着乳液平均粒径的减小而增强，由此推断聚戊烯醇纳米乳液可能具有对于抗生素抗菌活性的增效能力。进一步研究聚戊烯醇纳米乳液与抗生素抑菌的MIC值和FIC指数(见表2)，可以有效地说明其协同抗菌作用。
表2 不同样品的MIC值及联合FIC值Table 2 MIC and FIC index of the different samples
1)括号中前者为抗生素，后者为GBP-1 the former is antibiotics, the latter is GBP-1 in bracket; 2)*:协同作用synergistic effect (0 表2的结果表明，与其他抗生素相比，GBP-1与硫酸庆大霉素(G)混合对金黄色葡萄球菌具有协同抗菌作用(FIC指数为0.5)，混合样抑菌圈直径为(25.8±0.1)mm， MIC值为33 mg/L(GBP-1为32 mg/L，硫酸庆大霉素为1 mg/L)。GBP-1与环丙沙星(C)、硫酸庆大霉素、红霉素(E)混合样对大肠杆菌具有相加作用，以及与氨苄西林(A)、环丙沙星、红霉素、多粘菌素B硫酸盐(P)混合样对金黄色葡萄球菌具有相加作用，FIC指数范围为0.75～1。GBP-1与氨苄西林、多粘菌素B硫酸盐混合样对大肠杆菌具有无关作用，FIC指数为3。由此，有必要在亚抑菌浓度条件下研究聚戊烯醇纳米乳液、硫酸庆大霉素及其混合样品对金黄色葡萄球菌在不同时间段的杀菌曲线。 2.2 对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线 图1 亚抑菌浓度下不同样品对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线Fig.1 Time-killing curves of S. aureus in different samples under sub-MIC conditions 在亚抑菌质量浓度下，GBP-1、硫酸庆大霉素(G)及其混合样品对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线如图1所示。由图1可知，在0～6 h时，硫酸庆大霉素的抗菌活性比其与GBP-1的混合样品强； 6～24 h时，GBP-1与硫酸庆大霉素混合样品的抗菌活性明显强于硫酸庆大霉素，且抗菌活性能保持一定的强度而不减弱，而硫酸庆大霉素12 h后的抗菌作用逐渐减弱。然而，0～24 h时GBP-1本身始终保持着微弱的抗菌作用。因此，可以看出，聚戊烯醇纳米乳液与硫酸庆大霉素混合可以有效地提高对金黄色葡萄球菌的抗菌效果并延长抗菌时间。 2.3 讨论 有研究报道，植物中某些活性成分的纳米乳液和聚合物胶束可作为良好的载体传输系统，能够表现出更优异的口服生物利用度和生物功效(抗炎、抗癌等等)[14]。因此研究不同粒径的聚戊烯醇纳米乳液与抗生素的联合抗菌作用，可以有效证明纳米分散对于聚戊烯醇对抗生素药物抗菌效果以及抗菌时效的增强作用。有研究指出[15]倍半萜类化合物作为膜的渗透促进剂可以提高透过膜的效率，而这类物质可能来自其结构相似的细胞膜类脂。Cornwell 等[16]发现橙花叔醇和法尼醇比红没药醇更适合作为有效的透皮促进剂，相比其它萜类化合物，这些化合物分子中含有更长的碳链，并与细胞膜内部的双层结构结合可以发挥重要的促进透过作用。相比倍半萜类化合物，聚戊烯醇具有更长的碳链，可以更有效地增强细胞膜的透过性。此外，在真核生物和细菌生物膜中也发现了未改性的聚戊烯醇存在，这也为聚戊烯醇联合抗生素的协同抗菌作用奠定了理论基础。有大量证据表明，聚戊烯醇可以有效地增加细胞膜的流动性、离子渗透性以及形成双层六角II形的倾向[17]。 聚戊烯醇纳米乳液与抗生素联用提高抗菌效果的现象与当前报道具有一定的关联性，上述研究结果也表明，聚戊烯醇与不同种类的抗生素联用时表现出的体外抗菌效果增强能力，具有非特异性以及一定的广泛性。结合聚戊烯醇生物膜生物活性研究可以预见，其它类细胞质靶向抗菌药物包括食品防腐剂、消毒剂、杀菌剂，以及其他抗生素与聚戊烯醇联用也将表现出增强抗菌活性的作用。由于聚戊烯醇与细胞膜的渗透交换作用，由此推断，作用于细胞膜的抗菌活性化合物更容易受到外源性聚戊烯醇增加的影响，即增强其抗菌性能。本研究结果反映了硫酸庆大霉素支持这一理论。因为除了与细菌核糖体的相互作用，阳离子氨基糖苷类抗生素硫酸庆大霉素也具有破坏膜稳定性的作用[18]。 3.1 银杏叶聚戊烯醇纳米乳液与5种抗生素的协同抗菌作用研究结果表明，聚戊烯醇乳液配伍抗生素的抑菌圈直径随着乳液平均粒径增大而减小，由此推断聚戊烯醇纳米乳液可能具有提高聚戊烯醇自身的增效能力。 3.2 聚戊烯醇纳米乳液与硫酸庆大霉素混合对金黄色葡萄球菌具有协同抗菌作用(FIC指数为0.5)，混合样抑菌圈为(25.8±0.1)mm， MIC值为33 mg/L(GBP-1为32 mg/L，硫酸庆大霉素为1 mg/L)。 3.3 聚戊烯醇与硫酸庆大霉素混合可以有效地提高对金黄色葡萄球菌的抗菌效果并延长抗菌时间。聚戊烯醇的抗菌增效作用有望促使其在药物以及食品防腐剂、消毒剂、杀菌剂等领域的开发及应用，并为银杏资源的综合利用拓展新的方向。 [1]CHOJNACKI T,SWIEZEWSKA E,VOGTMAN T.Polyprenols from plants-structural analogues of mammalian dolichols[J].Chemica Scripta,1987 (27): 209-214. 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Antibacterial Activity ofGinkgobilobaLeaves Polyprenols Nanoemulsion in Combination with Antibiotics TAO Ran1,2, WANG Chengzhang1,2, YE Jianzhong2, ZHOU Hao1,2, CHEN Hongxia2 (1.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091, China; 2.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization;Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering,SFA;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province, Nanjing 210042, China) The synergistic antibacterial effects ofGinkgobilobaleaves polyprenols nanoemulsion (GBP) combined with five types of antibiotics，i.e.， ampicillin (A), ciprofloxacin (C), gentamicin sulfate(G), erythromycin(E), and polymyxin B sulfate (P), were determined through analyzing the average diameter of the inhibition halos, minimal inhibitory concentration (MIC), fractional inhibitory concentration (FIC) index and the time-killing curves under sub-MIC conditions. The results showed that the antibacterial effect of polyprenols nanoemulsion combined with the antibiotics enhanced with the increase of the average diameter of polyprenols nanoemulsion. The antibacterial effect of polyprenols could be improved by nanoemulsion. The polyprenol combined with gentamicin sulfate had synergistic antibacterial effect againstStaphylococcusaureuswith the FIC index of 0.5, the diameter of the inhibition halos of (25.8±0.1)mm, and the MIC value of 33.0 mg/L. The time-killing curves showed that the antibacterial effect and the antibacterial time could be increased after polyprenols mixed with gentamicin sulfate. Ginkgobiloba;polyprenol;nanoemulsion;antibiotic;antibacterial activity 10.3969/j.issn.0253-2417.2017.01.010 2016- 01- 06 中国林科院林业新技术所基本科研业务费专项资金(CAFINT2014C10)；江苏省自然科学青年基金项目(BK20150070)； 江苏省林业三新工程项目(LYSX[2014]09) 陶 冉(1982— ),男，江苏连云港人，助理研究员，博士，主要从事天然产物化学的研究；E-mail:trmoon1949@163.com *通讯作者：王成章，研究员，博士，博士生导师，主要从事天然产物研究与利用方面的工作：E-mail:wangczlhs@sina.com。 TQ35 A 0253-2417(2017)01- 0081- 06 陶冉，王成章，叶建中，等.银杏叶聚戊烯醇纳米乳液联合抗生素抗菌活性研究[J].林产化学与工业，2017，37(1)：81-86.
3 结 论
