原发性胆汁性胆管炎小鼠模型的研究进展

张冀豫， 范兴良

(上海中医药大学附属市中医医院， 上海 200071)

原发性胆汁性胆管炎小鼠模型的研究进展

张冀豫， 范兴良

(上海中医药大学附属市中医医院， 上海 200071)

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以小叶间胆管破坏，炎性因子浸润为主要特征的自身免疫性疾病。PBC以抗线粒体抗体升高为主要特点，最终导致肝内胆管胆汁淤积、肝纤维化甚至肝硬化。该病目前发病机制尚未完全清楚，也无理想的治疗方案。因此，有必要寻找一种与PBC相匹配的动物模型对PBC的发病、治疗、转归进行研究。简述胆管结扎模型、药物模型、抗原模型、基因自发模型等方面的进展，旨在总结归纳近年来发表的PBC小鼠模型的特点与局限，为PBC模型的选择和研究提供依据。

原发性胆汁性胆管炎； 疾病模型, 动物； 综述

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以小叶间胆管破坏，炎性因子浸润为主要特征的自身免疫性肝病，以中年女性多发。目前，PBC发病原因尚未明确，可能由环境、细菌感染、基因等诸多因素引起[1-3]。PBC的病理表现为肝汇管区淋巴细胞浸润，CD8+T淋巴细胞侵犯胆小管上皮细胞，造成肝内胆汁淤积及肝硬化[4]；临床以出现抗线粒体抗体(AMA)、ALP及IgM升高为特征性表现。近年来，PBC治疗不断完善[5]，PBC动物模型的研究不断深入，现对国内外近年来PBC实验小鼠模型研究进展进行综述，为研究PBC提供选择和依据。

1 胆管结扎模型

胆管结扎(bile duct ligation, BDL)模型是通过结扎小鼠胆总管，造成胆总管阻塞，毛细胆管进行性扩张，肝细胞浸润，进而引起局部炎症，最终引起肝硬化。该方法于胸骨下切口，玻璃分针剥离胆管脂肪，5-0结扎线进行胆管结扎。Duwaerts等[6]将C57BL/6雌性小鼠胆总管结扎，3 d后发现小鼠体内LY6C单核细胞和CD11b增加，小鼠肝脏病理切片出现Kupffer细胞和单核巨噬炎细胞(IMNPs)浸润，提示炎症浸润是BDL的主要特征。Aller等[7]阐释了BDL模型炎症浸润的机制，BDL模型的肝损伤是基于胆汁淤积而出现局部炎症、细胞膜转运异常、细胞代谢紊乱等一系列问题。尽管该模型手术方法成熟，成模率高，实验成本低，可造成胆总管阻塞，肝内胆汁淤积，但并未涉及引起PBC相关的特异性抗体AMA等因子升高，因此，该模型多用于胆汁淤积性疾病的研究。

2 药物模型

Wakabayashi等[8]腹腔注射小牛血清蛋白(BSA)和2-辛炔酸(2-octynoic acid)共轭体(100 μg/25 μl)免疫C57BL/6雌性小鼠，并通过相同方法注射包含结核分枝杆菌H37Ra(10 mg/ml)完全佐氏制剂24周后，发现100%小鼠出现胆管炎，炎性因子浸润，肿瘤坏死因子(TNF)α等指标上升，特异性CD8+T淋巴细胞表达CD44升高。但该模型仅能表现PBC的病理特点，由于缺少AMA，使得该模型在PBC免疫学表现上存在缺陷。Fickert等[9]采用0.1% DDC (diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)饮食喂养2个月龄雄性瑞士白化病小鼠8周，喂养4周后小鼠出现胆管阻塞以及谷胱甘肽排泄减少，伴有肝纤维化和大胆管损伤。8周实验后，小鼠胆道卟啉和血管细胞黏附分子增加，同时DDC诱导了骨桥蛋白和TNFα表达。此模型病理表现与PBC类似，表现为小鼠胆管和胆管周围损伤。该模型可观察外源性因素诱导慢性胆道疾病的机制和胆管纤维化，成本较低，但DDC药物模型中缺少特异性AMA指标。

聚肌胞苷酸(polyI:C)可有效诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)，并影响自身免疫。Okada等[10]在雌性C57BL/6小鼠体内1周2次腹腔注射polyI:C(5 mg/kg)，第8周小鼠汇管区出现单核细胞浸入，并且小鼠体内出现大量的免疫球蛋白聚集以及淋巴活化细胞，16周后所有实验小鼠血清中均可检测到AMA。郭晓霞等[11]重复该实验，发现在第24周AMA-M2阳性率达100%，同时肝脏汇管区出现碎屑样坏死和纤维化，并有大量炎性细胞浸润。为了研究polyI:C模型的蛋白组学，Song等[12]将注入poly I:C的控制组与对照组小鼠对比，发现polyI:C可以使小鼠肝线粒体表达的9个蛋白表达下调，20个蛋白上调。表明polyI:C小鼠模型可以使线粒体蛋白质组差异表达，差异表达的蛋白参与了脂质代谢，类固醇激素和胆汁酸的合成。有学者在polyI:C腹腔注射时联合药物协同，以寻找更完美的PBC匹配。Ambrosini等[13]在实验中将小牛血清蛋白和2-辛炔酸(2OA-BSA)与polyI:C联合作用小鼠，发现除AMA 100%阳性外，CD8+T淋巴细胞和肝纤维化出现了大幅升高，表明类似Toll样受体的poly I:C联合2-辛炔酸可更好的模拟人PBC的病程变化，与单纯2-辛炔酸药物模型相比，联合作用会增加发生肝纤维化的概率。该模型方法简单、可重复性高，很好的模拟人PBC生化、免疫和病理表现，深受研究者青睐。

3 抗原模型

新鞘脂菌是一种革兰氏阴性菌，具有与PBC患者丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)抗原表达相同的鞘糖脂CD1，可被限制性自然杀伤细胞(NK T淋巴细胞)识别[14]。Mattner等[15]发现将新鞘脂菌5×107cfu腹腔注射感染C57BL/6、 NOD、以及 SJL品系小鼠，2周后所有品种的小鼠出现体内PDC-E2及AMA的聚集，并有T淋巴细胞聚集浸润肝内小胆管的现象，AMA抗体可出现80%阳性，这与人PBC的疾病特征类似。但该细菌抗原模型并不会出现肝纤维化的表现[16]。除新鞘脂菌外，Wang等[17]将PBS与大肠杆菌缓冲液静脉注射非肥胖型糖尿病(NOD)AMA小鼠，结果小鼠出现了AMA阳性以及胆管炎症，4周后实验组小鼠AMA浓度约为对照组5倍。这可能由于大肠杆菌中的肽序列与PDC-E2 中6～8个氨基酸的序列相同，因而产生AMA等因子[18]。也有报道[19]认为尿路感染是PBC的诱因，大肠杆菌刺激导致尿路感染导致PBC发病。但此类模型通过大肠杆菌刺激会使PBC小鼠造模时合并小鼠尿路感染，降低制备模型的特异性。

将纯化的AMA-M2和完全弗氏佐剂(1 mg/ml)腹腔注射C57BL/6小鼠，也有AMA出现，联合试剂在免疫后第66周小鼠体内出现AMA-M2抗体(100%)，但该模型的制备时间较长。并且该模型腹腔注射小鼠主要引起肝内小胆管损伤，ALT、TBil无显著变化，与早期PBC发病相似[20]。

4 基因自发模型

DnTGFβ转基因小鼠是PBC模型中应用较为广泛的一种。将转化生长因子(TGF)加入CD4的启动子下，构成了DnTGF-βRⅡ模型小鼠。该模型小鼠会限制T淋巴细胞的表达，100%会产生AMA，以及PDC-E2、BCOADC-E2、OGDC-E2等自身抗体，同时由于TGF的作用会引起肝纤维化[21]。该模型的汇管区炎症类似人PBC淋巴细胞浸润。在转基因小鼠特异性损伤TGFβ信号中，只在T淋巴细胞识别抗原，出现自身免疫性胆道疾病，因此可认为此模型是对人PBC的模拟[22]。Bernuzzi等[23]通过实验发现在不同T淋巴细胞亚群中，PBC患者的亚群CD8 T淋巴细胞是大多数肝纤维化发病的致病因素。有学者[24]将CD4与CD8 T淋巴细胞分别转输到免疫缺陷小鼠体内，发现在CD8 T淋巴细胞作用下，小鼠体内出现了更高水平的TNFα、INFγ等炎性因子。此模型可以通过CD8 T淋巴细胞的作用造成类似PBC的病理特征。但值得注意的是，DnTGFβ小鼠在AMA表达和淋巴细胞浸润的同时会对小胆管产生损伤，并伴有结肠炎的发生[25]。

C3c4转基因鼠是另一种PBC模型鼠，由非肥胖糖尿病小鼠(一种自发的T淋巴细胞攻击胰岛β细胞自身免疫性Ⅰ型糖尿病模型鼠)发展而来，该模型是由于3,4染色体的B6/B10胰岛素依赖性糖尿病(IDD)位点异常，并自发出现自身免疫性胆管疾病，淋巴细胞浸润，抗核抗体(ANA)阳性，最终导致胆道梗阻[26]。该模型AMA在第9周到第10周可以达到56%。并且最终约30%的小鼠会出现肝纤维化，以及胆管持续淤积造成模型失败。超过8个月龄的雌性小鼠体内有更高水平的IgM dsDNA、 IgG dsDNA和IgG ssDNA，显示该模型雌性较雄性免疫表达更符合PBC的特征[27-28]。除相应的PBC炎症因子释放外(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和PDC-E2抗体)，通过组织学分析显示，肝切片出现破坏性胆管炎、肉芽肿形成和嗜酸性粒细胞浸润。并且随着时间推移该模型小鼠肉芽肿的比例增加，而肠内炎症和肝纤维化的比例不高[27,29]。

IL-2Rα-/-小鼠存在自发性的淋巴细胞浸润和胆管损伤。Yao等[30]发现IL-2受体α缺失会出现类似PBC的自身免疫肝病。IL-2Rα/CD25 (IL-2Rα-/-)缺陷小鼠，与同窝野生型小鼠相比，该小鼠除会出现PBC特异性抗体AMA外，IFNγ、TNFα、IL-2、IL-12p40比例升高，同时表现CD4、CD8+T淋巴细胞浸润。IL-2Rα-/-小鼠模型AMA 100%表达，约有80%会出现ANA。同时该模型会对小胆管、大胆管产生损伤。但此模型未见肝脏纤维化，而且会使结肠炎的发生风险增高。研究发现该模型小鼠伴有肠道炎症、肉芽肿、嗜酸性粒细胞浸润的发生，并且具有年寿短的特点[31-32]。

AE2基因缺陷小鼠是一种胆道上皮阴离子交换通道的缺陷小鼠。在肝内胆管上皮的研究中，Chen等[33]发现胆管上皮细胞可以表达多种抗原识别受体，激活免疫通路。胆管上皮中Cl-/ HCO3-阴离子交换剂(AE)2参与体内PH跨膜调节和胆汁运输。在PBC患者的肝活组织检查标本以及血液中发现AE2基因表达的减少，并且AE2基因缺陷小鼠模型的胆管细胞出现了氧化应激和抗原呈递，而同时AE2a,b-/-缺陷小鼠发现其组织相容性复合物Ⅰ升高，这也促进了小鼠PBC的发生[34]，表明阴离子交换通道的缺陷对小鼠胆管的上皮细胞会产生影响。通过AE2a,b-/-缺陷小鼠的制备发现除了AMA升高外(40%～80%)，IL-12P79和CD8+、INFγ均会升高。在组织学上，30%的小鼠显示在汇管区及周围的胆管周围有CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润，胆管梗阻周围有轻微的纤维化。该模型中约有1/3的小鼠会出现周围胆管损伤和炎性浸润，合并结肠炎、肝纤维化，同样该模型会出现迟发以及难以繁衍的问题。

相比较其他小鼠模型基因自发模型在实验环境，实验成本上要求较高。目前国内的PBC小鼠多以药物模型和抗原模型为主。尽管基因自发模型的内源性匹配度高，但多数转基因小鼠存在并发症以及难以繁衍的问题。

5 结论

尽管目前PBC的发病机理并不是非常清楚，但可以肯定的是PDC-E2升高等因素会引起AMA升高，并出现肝内小胆管损伤及肝纤维化。PBC动物模型和人类在组织学和免疫学有很多的相似性。但是动物模型本身具有限制性，在诸多的模型中不可避免会出现PBC以外的并发症，诸如肝内肉芽肿、结肠炎，这与严格界定的PBC疾病有一定的差距。有研究从基因遗传阐释PBC的发病，发现PBC疾病与X染色体异常去甲基CXCR3启动子相关[35]。这也阐明了由于XY染色体的差异，临床中PBC女性发病高于男性。而现有的模型还不能完全达到制备的雌性小鼠AMA阳性率高于雄性小鼠，也不足以从免疫细胞本身活动对于PBC的影响解释PBC的发病机理。不同的模型各有优劣，因此对于PBC模型还有待进一步研究，寻找更合适的匹配模型。

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引证本文：ZHANG JY, FAN XL. Research advances in the mouse model of primary biliary cholangitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(11): 2235-2238. (in Chinese)

张冀豫， 范兴良. 原发性胆汁性胆管炎小鼠模型的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(11): 2235-2238.

(本文编辑：邢翔宇)

Researchadvancesinthemousemodelofprimarybiliarycholangitis

ZHANGJiyu,FANXingliang.

(ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China)

Primary biliary cholangitis (PBC) is an autoimmune disease characterized by the destruction of interlobular bile ducts and infiltration of inflammatory factors. An increase in anti-mitochondrial antibody is the major feature of PBC and may eventually lead to intrahepatic cholestasis, liver fibrosis, and even liver cirrhosis. The pathogenesis of this disease remains unclear, and there is no ideal treatment regimen. Therefore, it is necessary to find an animal model matching with PBC, in order to study the pathogenesis, treatment, and prognosis of PBC. This article introduces the research advances in bile duct ligation models, drug models, antigen models, gene models, and spontaneous models, in order to summarize the features and limitations of the mouse model of PBC in the articles published in recent years and provide a basis for the selection and research of PBC models.

primary biliary cholangitis； disease models, animal； review

R575.22

A

1001-5256(2017)11-2235-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.041

2017-08-22；

2017-10-10。

上海市卫生和计划生育委员会中医药科研专项课题(2016LP032)

张冀豫(1994-)，男，主要从事中西医结合治疗慢性肝病方面的研究。

范兴良，电子信箱：1212fxl@163.com。