长链非编码RNA调控自噬在急性心肌梗死后造影剂所致肾损伤中的发生机制△

刘勇，贝伟杰，崔同涛，王坤，李华龙，陈纪言，谭宁，陈世群，陈鹏远

［广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510080］

·综述·

长链非编码RNA调控自噬在急性心肌梗死后造影剂所致肾损伤中的发生机制△

刘勇，贝伟杰，崔同涛，王坤，李华龙，陈纪言，谭宁，陈世群，陈鹏远

［广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510080］

急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者行急诊经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治疗后造影剂所致急性肾损伤（contrast induced-acute kidney injury，CI-AKI）发生率高，且增加近期和远期不良心肾事件。肾小管上皮细胞的自噬在急性肾损伤的发生中起着重要作用，生物信息学分析包括gene ontology（GO）富集、通路分析发现，Lgmn与哺乳动物参与自噬的特异性基因becclin-1基因可以富集在一起，两者之间具有功能相似性，尚不明确长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是否通过Lgmn调控自噬而影响CI-AKI发生，本文对LncRNA参与自噬调控在急性心肌梗死后造影剂所致肾损伤中的发生机制进行综述。

心肌梗死；LncRNA；自噬；造影剂；急性肾损伤

造影剂导致的急性肾损伤（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）是经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治疗的常见并发症，它可延长患者的住院时间、增加住院费用和增加病死率，从而增重社会医疗负担［1-2］。行急诊PCI治疗的ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患 者是发生CI-AKI的高危人群［3-5］，CI-AKI的发生显著增加STEMI患者死亡等不良事件发生风险，即便是血流动力学相对稳定的左心室射血分数保留的STEMI患者也如此［6］。

目前认为AKI的发生与自噬、凋亡等机制相关［7-8］，但自噬是否参与CI-AKI的发生、发展尚不明确。Beclin-1基因也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。近年研究发现，其广泛参与AKI的自噬发展过程［9］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一组转录物长度为200 nt（核苷酸），缺少特异完整开放阅读框并且无蛋白质编码功能的RNA，在细胞周期、增殖、迁移和代谢等方面发挥重要作用［10］。mRNA是从DNA转录合成的带有遗传信息的一类单链RNA，其作为蛋白质合成的模板，决定肽链的排列顺序。随着LncRNA功能逐步显现，其发挥调节的机制成为进一步研究的热点。早期认为原位调控是LncRNA作用的唯一机制，它通过招募形成染色质修饰复合物而沉默临近基因转录，后研究发现LncRNA的远程调控在生物体内广泛存在。LncRNA的作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚，目前发现的参与哺乳动物基因活动的LncRNA有上千个，其调控基因表达的机制具有共性，一般来说，LncRNA主要从表观遗传学、转录调控和转录后调控等3个层面实现对基因表达的调控［11］。

我们前期研究发现CI-AKI组的自噬相关蛋白beclin-1表达升高，LncRNA XLOC_036125和与之空间位置相邻的Lgmn亦表达升高，且通过生物信息学分析发现Lgmn与beclin-1功能相似。但是，尚不明确LncRNA是否通过Lgmn调控肾小管上皮细胞自噬而影响CI-AKI发生。因此，本文将在前期研究基础上，结合国内、外的研究状况及发展动态，阐述建立贴近临床急性心肌梗死并注射造影剂致AKI的动物模型的优越性和必要性，为下一步开展基于LncRNA通过Lgmn调控肾小管上皮细胞自噬的研究提供依据，为临床逆转CI-AKI的发生、发展提供依据，为解决临床棘手STEMI患者急诊PCI治疗后导致的AKI提供一种新策略。

1 急性心肌梗死后造影剂所致肾损伤模型

目前认为CI-AKI发病机制为全身血流动力学改变导致的肾髓质缺血、缺氧和造影剂对肾小管上皮细胞的直接损伤［12］，令人遗憾的是，既往关于CI-AKI的基础研究大部分基于相同的CI-AKI动物模型，如通过联合脱水，使用非甾体类药如吲哚美辛、肾毒性药物如顺铂，高渗造影剂如泛影葡胺等，建立大鼠的CI-AKI模型［13］。Liu等［14］通过在5/6-肾切除联合脱水大鼠，评价两种造影剂的适用性；Fernandes等［15］利用5/6肾切除大鼠研究慢性高血糖和慢性肾病患者在诊断或介入治疗时造影剂对肾功能的影响；Su等［16］在高渗造影剂碘普罗胺诱导的CI-AKI大鼠研究阿托伐他汀对糖尿病肾小管细胞凋亡的保护作用及其机制。然而，这与临床实践中患者发生CI-AKI的机制明显不同。并且，目前临床相关的指南已明确建议，患者在接触造影剂前停用非甾体类药物和避免使用肾毒性药物及高渗造影剂等，而建议使用低渗或者等渗造影剂。

除了造影剂的使用，缺血（例如低灌注、术后出血、脱水、休克或脓毒症等）也是临床患者发生AKI的一大病因。对于缺血导致的AKI也被进行了大量的研究，如Le Clef等［17］对没有行肾对侧切除术的小鼠进行单侧肾缺血再灌研究AKI导致的长期肾小管间质纤维化的研究进展；Peer等［18］使用摘除单侧肾，同时对对侧肾进行完全缺血再灌注的SD大鼠模型评价外源性DNAse-I是否能在发生AKI时对肾脏起到保护作用；Wei等［19］对胖鼠进行单侧肾脏缺血再灌注诱导肾损伤，研究替米沙坦对肾脏的保护作用。20多年来，肾完全缺血再灌模型被用来研究人类缺血性肾脏疾病［20-21］。简单统一的肾脏损伤反应导致这种模型被肾脏的研究者广泛使用。虽然大量的对于AKI的认识来源于这个模型，但是它是否能适当地反映人类缺血性肾脏疾病仍然是一个大问题。除了在肾部分切除术中，所有别的形式的AKI在人类的发生、发展中并不是由于完全阻断血液的供应。因此，潜在的机制和受到影响的细胞类型可能完全不同。已有研究证明，对动物行冠状动脉左前降支结扎术导致小鼠出现与临床患者行心肺通路手术后具有相似的肾病发病机理，肌酐的升高和时间的进程与心肺通路手术后的情况非常相似。而且，AKI的严重程度与人类的AKI也十分的相似，与在人类中的研究相一致，中性粒细胞相关载脂蛋白（neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL）、肾脏损伤分子-1（kidney injury molecules-1，KIM-1）肾脏中的表达量显著升高［22］，说明这个模型与临床上缺血性肾病是非常接近的。

临床上的CI-AKI大多发生在对STEMI患者进行诊断或者行急诊PCI治疗后，发生CI-AKI的主要因素包括了STEMI患者血流动力学相对不稳定、左心室功能异常导致全身灌注不足。有研究证实，CI-AKI在急性冠状动脉综合征患者的发生率明显高于稳定型冠状动脉疾病患者，且在稳定型冠状动脉疾病患者调整后的预后影响的复合终点更明确［23］。临床上，CI-AKI发生、发展的影响因素有很多，包括造影剂、血流动力学状态、低血压、充血性的心脏衰竭等［1］。造影剂的使用与缺血作为STEMI患者发生AKI的两大影响因素，现阶段普遍使用的CI-AKI动物模型却并未将两者之间联系起来，建立与临床CI-AKI发生机制相似的动物模型对于将CI-AKI的研究转化于临床运用，具有必要性。

2 自噬在急性肾损伤发生、发展中的作用

自噬是由溶酶体介导的对细胞内蛋白质、脂质甚至整个细胞器进行降解和对营养物质回收，维持细胞内环境未定的生物过程。自噬现象在真核生物中的生物反应中普遍存在，是细胞反应于代谢、遗传、感染、缺氧等刺激的一种必不可少的细胞存活的适应途径［24-26］。

目前已知自噬的作用机制过程包括：（1）由双层膜结构始发；（2）双层膜结构的扩张延伸；（3）分化成熟成为自噬小体；（4）与溶酶体结合形成自噬溶酶体；（5）包裹摄入物质的降解［27］。研究发现，自噬可能参与氧化应激、内质网应激、TP53通路、BCL家族蛋白通路、UNC-51激酶1（unc-51-like kinase1，ULK1）及缺氧反应等信号通路调节细胞损伤。1998年Beth等在酵母的杂交克隆筛选中发现Beclin-1通过与磷酸肌醇3激酶（PI3K）结合而参与早期自噬的调节，参与自噬体的形成及调节其他自噬蛋白在自噬前体膜的定位。Beclin-1促进自噬小泡的成核和从细胞溶质招募蛋白质，是自噬体形成的标志。

自噬已被证实与大量的人类疾病，如神经退行性疾病、感染性疾病、癌症和炎症性疾病的发病机制存在关联性。Boya等［24］在研究自噬在视觉系统中的作用中发现，视网膜细胞的自噬功能障碍能导致一系列视觉系统疾病，比如黄斑变性、青光眼；Lopes de Faria等［28］在研究探讨自噬是否参与高糖饮食引起的糖尿病视网膜病变时发现，高糖环境能导致溶酶体功能障碍，引起自噬通路上的p62/SQTSM1大量堆积，致使视网膜细胞发生自噬功能障碍，导致细胞死亡。大量研究也证实了自噬在一些肾脏疾病发病机制中的作用，如糖尿病肾病、梗阻性肾病，IgA肾病，肾病性胱氨酸、马兜铃酸肾病、自身免疫性肾脏疾病和慢性环孢素A肾毒性。有关研究证明，糖尿病能引起的明显的肾小球细胞凋亡，而激活肾细胞的自噬功能能显著改善肾脏功能的混乱、肾小管的破坏、肾小管细胞的凋亡、线粒体的肿胀、氧化应激和炎症反应，降低肾小球肾小管的损伤，对肾脏起到一个保护作用［29］。Wu等［30］发现在缺血再灌注大鼠模型肾小管中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达增加，肾脏在此病理条件下自噬被激活。近来有研究发现，在顺铂处理的RPTC细胞中，通过药理抑制剂或基因敲除Beclin-1可抑制自噬过程，进而增加细胞凋亡，由此表明在顺铂诱导肾小管细胞损伤中，自噬可能具有保护作用。另外，通过具有肾素性的环孢霉素预处理的原代培养近端管状细胞中也发现自噬有参与细胞保护作用。而Wu等［30］在大鼠的肾脏缺血-再灌注实验中也发现在损伤的肾小管中，Beclin-1和LC3表达以及细胞凋亡表达同时增加，自噬及凋亡均能被缺血性预处理所抑制，最终观察发现肾损伤的程度得到改善，由此反映自噬可能参与加速细胞死亡的过程。

现有研究发现，造影剂可直接作用于肾小管上皮细胞，导致肾小管上皮细胞极性丧失，单向离子转运功能受损，细胞与细胞间、细胞与细胞基质间黏附能力下降，导致上皮细胞凋亡，造成急性肾功能损伤［12，31］。AKI可导致缺氧、营养物质及生长因子缺乏、能量欠缺、氧化损伤及内质网应激，进而诱发自噬的产生。而自噬可通过细胞保护机制降低大分子物质及细胞器损伤以应对应激反应［31］。因此，自噬在AKI中起重要作用，同时也是AKI新的作用靶点。目前，自噬机制在AKI发生、发展过程中是否具有抗凋亡作用或促细胞死亡机制尚不清楚，在CI-AKI中更是没有相关研究。因此，加深对肾小管上皮细胞自噬调控机制的研究，探讨其有效的防治措施，对延缓造影剂暴露后肾功能损伤的进程具有重要意义。

3 急性肾损伤中长链非编码RNA的差异表达

LncRNA广泛参与基因组的调节，其中最重要的功能就是参与基因组的表观遗传修饰，表观遗传的改变主要涉及DNA甲基化、核小体定位改变、miRNA表达异常、组蛋白乙酰化、染色质重构等过程［32］。研究已发现，LncRNA可导致染色质修饰复合物至特定的基因位点或特异性启动子区域，从而影响与细胞周期、细胞分化、凋亡、DNA修复、细胞黏附等相关基因的表达。

作为近几年生命科学研究最火的领域之一，LncRNA已被大量证实参与了多种人类疾病的发生、发展，提示LncRNA可能作为多种疾病诊断和预后的新型生物标志物。Yan等［33］在循环LncRNA尿路上皮癌相关1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）基因作为标记物用于急性心肌梗死的研究中发现，急性心肌梗死患者早期状态下，血浆中UCA1浓度会降低，但其浓度在急性心肌梗死后第3天会增加。此外，UCA1变化与微小RNA-1的表达呈负相关性。Huang等［34］在对心脏标本行全基因组转录的分析中发现，在缺血性心肌中差异性表达的145个lncRNA中的35个显示出与缺血程度强烈的表达有相关性。QU等［35］同样在对心肌梗死4周后的梗死周围区特异性表达的lncRNA和mRNA进行生物信息学分析，包括GO富集、通路和网络分析发现许多lncRNA在由心肌梗死引起的心肌纤维中的表达具有特征性。Lorenzen等［36］研究发现，AKI危重患者血循环可以检测到LncRNA，此LncRNA位于22号染色体为基因内反义LncRNA，作者将其命名为TrAnscript Predicting Survival in AKI（TapSAKI）。TapSAKI存在于肾组织并且在AKI患者血循环中其表达上调。为了确认TapSAKI潜在的可能起源，对缺氧肾内皮及小管上皮细胞进行检测发现在三磷酸腺苷损耗的小管上皮细胞内其表达丰富。然而，其并未对TapSAKI的释放机制以及其在肾脏中的具体作用进一步详细研究。Chen等［37］对肾细胞癌的临床病理、预后，以及根据不同的LncRNAs进行诊断的方法进行了一项系统回顾和分析探讨其临床价值时证明，LncRNA对肾细胞癌具有高度的敏感性，显著优于其他的生物标志物，可以检测早期阶段淋巴结的转移和远处转移，提示LncRNA可以成为肾细胞癌潜在的预后标志物。

基于包括以上的大量研究证明，病理组织中特异性表达的LncRNA可以通过原位调控或远程调控对基因的表达进行调节，本课题组前期利用高通量基因测序技术，筛选出在CI-AKI大鼠的肾组织中有显著性差异的LncRNAs，通过生物信息学软件分析及使用定量聚合酶链反应（Q-PCR）方法进行验证，最终确定研究目标基因LncRNA XLOC_036125。说明LncRNA的筛选是具有依据和可行性的。

自噬在AKI发挥重要作用，是肾细胞在发生AKI时自我保护的细胞生存途径［8］，基于LncRNA发挥的调控作用具有空间性的特性，对同样在肾组织中特异性表达且与LncRNA空间位置上临近的Lgmn进行生物信息学分析，确定其生物功能与自噬相关，我们有理由推断LncRNAXLOC_036125通过对Lgmn进行调控，发生肾损伤时对肾小管细胞的自噬活动进行调节。

4 急性肾损伤中Lgmn的差异表达

Lgmn mRNA是一种可编码天冬酰胺酰内肽酶的RNA分子。研究发现，在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌及许多神经系统肿瘤组织中，Lgmn高度表达，且Lgmn对于细胞的增殖分化有直接作用［38］。Hinkelbein等［39］研究高氧环境下对大鼠的肾功能损伤作用和相关蛋白的表达情况时发现，将大鼠置于高氧的环境下一定时间后，检测大鼠的肾脏组织中相关蛋白的表达，最后发现Lgmn蛋白的表达下调。Anders等［38］在研究大鼠肝脏细胞蛋白的多级自噬溶酶体处理过程中发现，Lgmn基因能特异性地抑制与自噬相关酶BHMT的裂解失活。Morito等［40］研究发现，lgmn在小鼠肾脏的近端小管细胞中高度表达，进而研究发现Lgmn蛋白在体外可以直接降解细胞外基质主要成分之一的纤连蛋白。研究Lgmn对培养的小鼠肾脏近端小管细胞中的纤连蛋白的作用时发现，在Lgmn蛋白的参与下纤连蛋白的降解发生在肾脏近端小管细胞的溶酶体上，据此推测Lgmn可能在通过降解近端小管细胞外纤连蛋白从而对细胞外基质进行重构的过程中扮演着重要的角色。同样，Shirahama-Noda等［41］发现在Lgmn蛋白缺陷小鼠肾脏细胞的溶酶体内积累了大量的大分子，从而证明Lgmn在溶酶体的降解系统中起着关键作用。但其在肾脏组织中的作用及机制仍不明确。本课题组前期同样利用高通量基因测序技术，发现CI-AKI大鼠的肾组织中Lgmn表达下调。

包括以上的大量研究已经证明了Lgmn与细胞的增殖分化相关，抑制自噬相关酶的裂解失活，在体外更是能直接降解纤连蛋白，说明lgmn具有促进细胞的自噬活动。在高氧环境中，肾细胞发生氧化应激反应，此时肾细胞的调亡增加，自噬下降，也验证了Lgmn促自噬的生物功能。

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R542.2+2

A

1007-9688（2017）06-0795-05

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.06.42

国家自然科学基金项目（项目编号：81670339）。

刘勇（1982-），男，博士，主治医师，研究方向为心内科疾病诊治。

陈纪言，E-mail：chenjiyandr@126.com；共同通信作者：谭 宁，E-mail：tanning100@126.com

2016-00-00）