青花菜种质资源遗传多样性的SSR分析

张志仙，何道根，朱长志，檀国印，高 旭

(台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

青花菜种质资源遗传多样性的SSR分析

张志仙，何道根*，朱长志，檀国印，高 旭

(台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

采用SSR分子标记技术，从50对引物中筛选出14对条带清晰、稳定性好的多态性引物分析了28份青花菜种质资源的遗传多样性。结果表明，14对引物在28份材料中共扩增出94条条带，多肽信息量为0.20～0.91。供试的28份材料的遗传相似系数为0.585 1～0.904 3，平均遗传相似系数为0.728 9。其中TN12和TN14亲缘关系最近(相似系数为0.904 3)，TN503和TN597亲缘关系最远(相似系数为0.585 1)。聚类分析表明，在遗传相似系数0.688处，28份青花菜材料可分为2大类。第一大类(Ⅰ)包括TN501、TN526等26份材料，第二类(Ⅱ)由TN539和TN597两个材料组成。同时，从主成分分析二维图结果来看， 28份材料分成4个组，第一组由TN539和TN597构成，第二组由TN55、TN591等6个材料组成，第三组由TN671等6个材料组成，第四组由14份材料组成。两种分类方法都得出TN539和TN597与其他26份材料亲缘关系较远的结果。结果表明，这28份青花菜种质资源总体遗传多样性较低，但部分材料存在较大遗传差异，为供试材料的利用和杂交亲本选配提供了参考。

青花菜；SSR；聚类分析；主成分分析；遗传多样性

青花菜(BrassicaoleraceaL. var.italica)是芸薹属重要的蔬菜作物之一。近年来，随着国内青花菜消费市场和种植面积的稳步提升，从事青花菜研究的机构也越来越多，并在品种选育方面取得了一些成果[1-3]。然而，青花菜起源于地中海沿岸，国内可利用资源少，且随着种子市场不育系品种的增加，收集新资源困难增大，再加上青花菜生长生殖周期长，因此，在育种研究中，充分合理鉴定、利用现有种质资源显得尤为重要。传统资源鉴定方法依赖于田间形态学观察鉴定，但易受环境和主观因素影响；而依靠田间大量的杂交组合试验通过F1的农艺性状表现来评价，工作量大，且具有一定的盲目性。利用分子标记技术同时结合田间考察可以简便、快速地系统区分优质种质资源，指导杂交组配，减少工作量[4-5]。

SSR标记以2～5个核苷酸为基本单位的串联重复序列，广泛存在于基因组中，为共显性遗传，重复性好，并且能在近缘种属之间通用[6]。荆赞革等[7]利用9个引物对20个青花菜基因型进行分子鉴定，共获得51个基因位点，多引物组合可鉴别出所有青花菜基因型。孙继峰[8]利用EST-SSR和gSSR标记对青花菜DH群体进行遗传多样性分析，结果显示，79对EST-SSR引物共扩增出285个条带，平均每对引物扩增3.61条，多态性比例85.96%，为DH群体利用提供了理论基础。这些研究表明了SSR在青花菜种质资源研究中的可行性。本课题组从事青花菜育种十余年，收集并纯化了大量青花菜种质材料。在此基础上，本试验采用SSR技术对28份经多年自交纯化、整齐度较高的青花菜种质材料进行遗传多样性和遗传关系分析，为青花菜杂交亲本的选配提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为28份经多年自交纯化、整齐度较高的青花菜种质材料(表1)。2014年9月13日在浙江省台州市农业科学研究院实验农场播种育苗，1个月后定植于大棚，常规栽培管理。全生育期观察植株长势、主要营养器官等特征，去除异株，以保证每份自交系材料的纯度。

1.2 青花菜自交系的遗传多样性和亲缘关系分析

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法[9]提取植株幼嫩叶片总DNA，略改进。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，超微量分光光度计(Quawell，美国)测定其浓度和质量，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增与毛细管电泳

选用50对SSR引物进行PCR分析，其中14对为本实验室根据NCBI数据库中青花菜EST和mRNA数据筛选设计的EST-SSR引物，另外36对引物选自用于甘蓝属植物分析的论文。

SSR-PCR反应体系为15 μL，包括1.5 μL 10倍PCR缓冲液，25 mmol·L-1Mg2+0.3 μL，20 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1引物 0.9 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL和5 U·μL-1Taq酶 (上海生工生物技术工程有限公司) 0.15 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃保温10 min；4 ℃保存。

PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上检测筛选，保持电泳仪电压120 V，电泳30 min。将在琼脂糖凝胶上能形成清晰条带的PCR产物经过DNF-900-K0500 Reagent Kit试剂盒稀释处理后，采用Fragment AnalyzerTM通量SSR分析系统(AATI，美国)分离检测，PROSize 2.0分析软件收集数据并分析结果。

1.2.3 数据统计与分析

用PROSize2.0软件对Fragment AnalyzerTM高通量SSR分析系统收集的数据进行分析，结合人工分析与软件统计得出不同SSR引物对不同青花菜材料扩增得到的SSR标记片段，将SSR标记片段与Genescan-500分子量标准品比较得到不同片段长度大小，将有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，将数据输入Excel 2007表格中，构建(0，1)原始矩阵。

表1 青花菜自交系的植物学性状

Table 1 Description of botanical traits of broccoli inbred lines

名称Name代数Generations现蕾期Squaringstage株型Planttype叶色Leafcolor叶形Leafshape叶面蜡粉Leafwax花球形态Curdmorphology蕾粒AlabastrumsizeTN501F82014-12-06半直立Semi-erect绿Green圆Round中Intermediate平Flat粗LargeTN503F82014-12-06半直立Semi-erect深绿Drakgreen圆Round多Much高圆Highspherical粗LargeTN505F82014-12-09平坦Spreading深绿Drakgreen圆Round多Much高圆Highspherical中细Medium-fineTN526F82014-12-10半直立Semi-erect绿Green圆Round中Intermediate平Flat中粗MediumTN539F82014-12-06半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic多Much圆整Sphericalandround粗LargeTN549F82014-11-29半直立Semi-erect深绿Drakgreen圆Round中Intermediate高圆Highspherical细LittleTN591F92015-01-04平坦Spreading深绿Drakgreen椭圆Elliptic少Little块状Rough细LittleTN597F102014-12-12半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate圆整Sphericalandround中IntermediateTN659F102015-01-07半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic多Much平Flat不均UnevenTN671F102014-12-29平坦Spreading绿Green椭圆Elliptic中Intermediate块状Rough细LittleTN677F102015-01-04平坦Spreading绿Green椭圆Elliptic中Intermediate块状Rough细LittleTN705F72015-01-01直立Erect深绿Drakgreen近圆Ovatetoround多Much圆整Sphericalandround细LittleTN710F72015-12-25半直立Semi-erect绿Green圆Round中Intermediate平Flat细LittleTN715F62014-12-15半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic多Much高圆Highspherical细LittleTN727F62014-12-17半直立Semi-erect绿Green长椭圆Longelliptic中Intermediate块状Rough细LittleTN764F62014-12-23半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate高圆Highspherical细LittleTN771F62014-01-21半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate块状Rough中IntermediateTN783F62014-01-20平坦Spreading深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate边缘稍块Rough细LittleTN810F52014-01-17半直立Semi-erect深绿Drakgreen近圆Ovatetoround多Much高圆Highspherical中细Medium-fineTN856F52015-01-01半直立Semi-erect绿Green长椭圆Longelliptic少Little中圆Spherical中粗MediumTN903F42014-12-24半直立Semi-erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic多Much高圆Highspherical中细Medium-fineTN199F62014-12-26直立Erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate平Flat细LittleTN212F102015-01-23直立Erect深绿Drakgreen椭圆Elliptic中Intermediate块状Rough细LittleTN12F102014-12-15平坦Spreading深绿Drakgreen圆Round中Intermediate圆整Sphericalandround中IntermediateTN14F102014-12-16平坦Spreading深绿Drakgreen圆Round中Intermediate圆整Sphericalandround中细Medium-fineTN20F102014-12-21平坦Spreading深绿Drakgreen圆Round中Intermediate圆整Sphericalandround中细Medium-fineTN48F102014-11-29半直立Semi-erect深绿Drakgreen长椭圆Longelliptic中Intermediate圆整Sphericalandround中细Medium-fineTN55F102014-12-13半直立Semi-erect深绿Drakgreen长椭圆Longelliptic中Intermediate圆整Sphericalandround中细Medium-fine

利用GenAlEx6.502和Excel 2007计算各引物的多态信息含量(polymorphism information content，PIC)[10]。采用NTSYS-pc 2.10软件Qualitative data程序进行相似性系数计算，用非加权组平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)生成聚类分析图；同时基于相似性系数进行主成分分析，构建二维分析图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

用50对SSR引物对青花菜种质资源材料的多样性进行分析，其中14对能够得到清晰且多样性丰富的条带(表2、图1)。结果表明，14对SSR引物一共得到94个扩增条带，每对引物扩增数为3～14个，平均6.71个，扩增产物长度为98～372 bp。14对SSR引物多肽信息量PIC为0.20～0.91，平均为0.68(表2)。

2.2 亲缘关系分析

对28份青花菜种质资源的相似性研究结果显示(图2)，378对材料之间相似系数介于0.585 1～0.904 3，平均值为0.728 9，介于0.585 1～0.600 0的有4对(TN539和TN501、TN597和TN503、TN597和TN705、TN505和TN710)；介于0.600 1～0.700 0和0.700 1～0.800 0之间的分别有109和224个；介于0.800 1～0.904 3的41个，材料之间亲缘关系相对较近。其中TN503和TN597亲缘关系最远(相似系数为0.585 1)，TN12和TN14相似系数为0.904 3，亲缘关系最近。

表2 SSR引物基本信息

Table 2 Primers used for SSR analysis

编号No.名称Name引物序列PrimersequencesTm基序Repeat条带数BandnumberPIC引物来源ReferencesE2Br-est2-1AGATAAAGAAAGCAGACGG/TTGGTTAAAGCGAAAGTG50AGA30.36本实验室OurlabE11Br-est14-1CCAGAGGAGCAACCAA/CAACACGAGCATCTTACACTA50TCC40.71本实验室OurlabE12Br-est15-1AAGAAGAAATAACCCACGAGTACAAATAGGAATGGCAGA50CC30.20本实验室OurlabS1BN83B1GCCTTTCTTCACAACTGAT-AGCTAATCAGGTGCCTCGTTGAGTTC60(GA)11(AAG)490.85Szewc-McFaddenetal.,1996[11]S3BRMS042GGATCAGTTATCTGCACCACAATCGGAATTGGATAAGAATTCAA55(AAT)4,(CT)4(T)2(CT)440.57Suwabeetal.,2002[12]S4BRMS071CAAAGCGAGAAAGTGCAGTT-GAGAGTCCACGAAACTACTGCAGATT-GAAA6090.84Suwabeetal.,2002[12]S6FIT0284AGCAATAAGCCAGAAACTTGGTTCATCATCACAACTCTAACCT5590.79Iniguez-Luyetal.,2008[13]S9Na12C08GCAAACGATTTGTTTACCCGCGTGTAGGGTGATCTAGATGGG55CT140.91Loweetal.,2004[14]S12Ra2G09ACAGCAAGGATGTGTTGACGGATGAGCCTCTGGTTCAAGC55CT50.71Loweetal.,2004[14]S20OL10D08TCCGAACACTCTAAGTTAGCTCCGAGCTGTATGTCTCCCGTGC60CT90.83Loweetal.,2004[14]S24OL12G04CGAACATCTTAGGCCGAATCGGTTAACCTGCGGGATATTG55TC90.79Loweetal.,2004[14]S25Ra2E12TGTCAGTGTGTCCACTTCGCAAGAGAAACCCAATAAAG-TAGAACC60GA70.67Loweetal.,2004[14]S26Sn3734CCCCTTCCGGTTAAACAAATAAAACAGACTTTGCCCGTTG5340.60Walleyetal.,2012[15]S29BoCAM1GCTGATGTTGATGGTGATGGGCCGAAGCAGACAAATAAAAC55GA50.76Louarnetal.,2007[16]总和Sum94平均Average6.710.68

M，梯度DNA；A，引物S24对青花菜自交系TN549、TN591等11个模板的扩增条带图；B，引物E2对青花菜自交系TN677、TN705等11个模板的扩增条带图M， DNA ladder marker; Figure A and B represented the electrophoretograms of amplified by primers S24 and E2， respectively图1 引物S24(A)和E2(B)对部分材料的SSR电泳结果Fig.1 Electrophoretograms of products amplified by primers S24 (A) and E2 (B)

2.3 聚类分析

根据相似系数对这28份青花菜材料进行聚类分析，并构建聚类图(图3-A)。以遗传相似系数0.688为阈值，可将28份材料分为2个组群。第一类(Ⅰ)由TN501、TN526等26份材料组成，第二类(Ⅱ)由TN539和TN597两个材料组成。以0.735为阈值，可以将第一类(Ⅰ)分为6个亚类，Ⅰ-1由TN501和TN526两个青花菜材料组成；Ⅰ-2、Ⅰ-5、Ⅰ-6分别由TN526、TN20和TN771组成，Ⅰ-3和Ⅰ-4分别包含7个和14个成员。其中，Ⅰ-1类材料株型为半直立，花球平，蕾粒中粗，现蕾期为12月上旬，属早中熟类型；Ⅰ-2类株型半直立，花球平，蕾粒细，现蕾期为12月下旬，中晚熟类型；Ⅰ-3类花球圆整，蕾粒中细，现蕾期在12月中下旬，主要为中晚熟类型；Ⅰ-4类种质材料株型直立或平坦，蕾粒中细，现蕾期在12月中旬到1月下旬，偏中晚、晚熟类型；Ⅰ-5类株型半直立，花球块状，蕾粒中，现蕾期为1月21日，为晚熟材料；Ⅰ-6平坦，花球高圆，蕾粒中细，12月9日，偏早中熟材料。第二类(Ⅱ)青花菜材料主要特征为株型半直立，花球圆整，蕾粒中或粗，现蕾期为12月上旬，属早中熟材料。

利用NTSYSpc2.1软件对所有材料进行主成分分析，同时构建主成分分析二维图(图3-B)。根据材料在图中的位置分布， 28份材料被分成了4个组。第一组(Ⅰ)由TN539和TN597构成；第二组(Ⅱ)由TN55、TN591等6个材料组成，其材料基本特征为株型半直立或平坦，花球高圆或块状，蕾粒细，多属于中晚熟类型；第三组(Ⅲ)由TN671等6个材料组成，其特征多为：株型半直立或平坦，花球多圆整或平，蕾粒中细或细，现蕾期跨度大；第四组(Ⅳ)由14份材料构成，花球圆整，蕾粒细或中细，现蕾期跨度大。主成分分析从不同的角度更直观地对28份材料进行了亲缘关系分析，该结果与聚类分析均表明，TN539和TN597与其他26份材料亲缘关系较远。

3 讨论

在品种选育过程中，决定杂交组配成功的关键是亲本的选择，从杂种优势利用的角度看，通过适当选择群体遗传多样性丰富的亲本，更有助于我们培育出杂种优势明显的后代。因此对种质资源亲缘关系分析，与田间鉴定相配合，对指导种质鉴定、青花菜育种和未来的青花菜研究工作具有重要的意义。本研究利用筛选出的14对SSR引物对28份青花菜材料的遗传多样性进行了研究，一共得到94个扩增条带，每对引物平均6.71条，PIC在0.20～0.91之间，平均为0.68。利用不同的电泳方法对青花菜进行遗传分析的结果是有差异的。与李昕珈等[17]、孙继峰[8]的研究相比，本研究中每对SSR引物扩增的条带数较多，表明毛细管电泳检测SSR灵敏度、分辨率均比普通聚丙烯酰胺凝胶电泳效果好，还易于定量和自动化检测，目前已有研究将毛细管电泳和分子标记相结合进行作物的遗传分析[18-19]。但由于毛细管电泳对仪器要求和电泳成本均较高，应当根据实际实验需求来理性选择。

图2 青花菜378对材料相似系数矩阵Fig.2 Matrix of the similarity coeffcient among 378 pairs of broccoli inbred lines

图3 青花菜自交系的聚类分析(A)和主成分分析二维图(B)Fig.3 Dendrogram of cluster analysis (A) and principal component analysis (B) of broccoli inbred lines

相似系数是判断种质资源亲缘关系的标准之一。在植物亲缘关系研究中，相似系数越低则亲缘关系远，材料之间差异越大。王岚等[20]利用15条ISSR引物对33个来自国内外的青花菜种质进行了遗传多样性研究，33个青花菜品种的平均遗传距离为0.28。Lu等[21]利用74个RAPD和8个SSR引物研究发现，18个青花菜材料的相似距离为0.842 1～0.933 0。本研究中28个材料之间的相似系数为0.585 1～0.904 3，平均值为0.728 9，这些研究都表明青花菜种质资源的遗传基础相对狭窄。在378对材料中，TN12和TN14、TN727和TN764、TN856和TN48三组亲缘关系最近，相似系数分别达到0.904 3、0.872 3和0.872 3，这些相似系数高的材料极可能具有相同的遗传背景，而它们的植物学特性也表现出高度的相似性，比如TN12和TN14均株型平坦，叶色深绿，叶圆，蜡粉中，花球圆整。杂交亲本配组时，在保证花球优势性状的同时，应当尽量避免高相似系数材料组合的选择，保证杂种优势的最大化。

UPGMA法聚类分析和主成分分析二维图结果分别将这28份材料分为2和4类。聚类结果的不同主要是由其原理决定的。UPGMA法假设各分类群的进化速率相同，按照顺序依次将距离最小的两个材料(或材料组合)聚在一起直到所有的材料都聚到一个完整的系统发生树中。而主成分分析二维图是通过降维的统计方法，把多个指标转化为少数几个综合指标，降低观测的空间维数，获取最主要的信息，通过直观图像距离远近获取材料之间相关性的分析方法[22]。两种方法从不同角度对28个材料进行聚类，分类结果可以相互补充说明，两种聚类方法都证明TN539和TN597与其他26份材料的亲缘关系较远，利用这两个材料与其他材料杂交，更有可能获得突出的杂种优势。综上，本研究结果表明，这28份青花菜种质资源总体遗传多样性较低，但部分材料存在较大的遗传多样性，本试验为供试材料在杂交亲本选配利用方面提供了参考。

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(责任编辑 张 韵)

Genetic diversity analysis ofBrassicaoleraceaL. var.italicawith SSR markers

ZHANG Zhixian， HE Daogen*， ZHU Changzhi， TAN Guoyin， GAO Xu

(TaizhouAcademyofAgriculturalSciences，Linhai317000，China)

Simple sequence repeat (SSR) markers were used to analyze genetic diversity among 28 broccoli (BrassicaoleraceaL. var.italica) materials. Fourteen pairs of SSR marker primers selected from 50 pairs of SSR primers generated 94 polymorphic bands among these 28 materials. The polymorphism information content (PIC) ranged from 0.20 to 0.91. The overall genetic similarity values ranged from 0.585 1 to 0.904 3 with an average value of 0.728 9. Among them， TN12 and TN14 were the most similar while TN503 and TN597 were the most distant ones with genetic similarity values of 0.904 3 and 0.585 1， respectively. The cluster analysis divided the 28 broccoli materials into two clades (Ⅰand Ⅱ). Clade Ⅰ was constituted of 26 broccoli inbred lines and clade Ⅱ were formed by TN539 and TN597. While the result of principal coordinates analysis showed that all 28 materials were grouped into 4 clades， which consist of 2， 6， 6， 14 broccoli germplasm materials， respectively. Both of the two methods showed that TN539 and TN597 had a low genetic similarity with other 26 germplasm materials. These results revealed that 28 broccoli materials had a narrow genetic base while part of them had wide variations， which provide information for their use and the hybrid parents choice.

broccoli; SSR; cluster analysis; principal coordinates analysis; genetic diversity

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.08

2016-10-18

浙江省重点创新团队项目(2013TD05)；浙江省重大科技专项(2014C02006)；台州市农业重大专项(14ZD05)；台州市重点科技创新团队(2014-1)； 台州市院地合作科技项目(TYD-001-2)；浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903-3-2)

张志仙(1988—)，女，山西古交人，硕士，农艺师，主要从事青花菜遗传育种。E-mail: yyybdzzxoh@163.com

*通信作者，何道根， E-mail: daogenhe@163.com

S635.3

A

1004-1524(2017)02-0228-08