响应面法优化螺旋藻培养基

谢丽丹，王素英

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300400)

响应面法优化螺旋藻培养基

谢丽丹，王素英*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300400)

为了优化螺旋藻培养基的基本配方，以纯碱生产废料、硝酸钠(NaNO3)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)为自变量，以螺旋藻藻蓝蛋白含量为响应值，应用Box-Behnken中心组合原理建立数学模型，进行响应面分析(RSM)，确定螺旋藻培养基的最佳配方。结果表明，螺旋藻培养基最佳配方为纯碱生产废料17 g、硝酸钠(NaNO3)2 g、氯化钾(KCl)1 g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1.6 g，在此条件下，螺旋藻藻蓝蛋白实际含量达到0.269 3 mg·L-1，与室外养殖采用的半合成培养基相比，藻蓝蛋白含量提高了23%。

螺旋藻；响应面；培养基优化；藻蓝蛋白

螺旋藻因富含蛋白质、碳水化合物、维生素、不饱和脂肪酸及微量元素，已被成功开发应用并实现产业化生产，但随着螺旋藻应用领域的扩大，养殖产量远不能满足人们日益增长的需求[1]。本课题组在螺旋藻资源调查、多样性分析的研究过程中发现，目前螺旋藻室内培养主要采用合成培养基[2-4]，室外养殖主要采用添加天然碱的半合成培养基[5]。在实验室条件下，单位时间内螺旋藻在半合成培养基中生长获得的生物量远高于合成培养基，因此初步认为半合成培养基更有利于螺旋藻的生长。

半合成培养基的主要成分是纯碱生产废料、磷酸盐、氯化钾和硝酸钠，在不同的养殖场各成分的用量存在一定差异。本试验以内蒙古东胜螺旋藻养殖基地的经验配方为基础，拟采用响应面法对该配方主要成分的用量进行优化，以达到提高养殖产量和质量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻(内蒙古东胜螺旋藻养殖基地) 由本实验室保藏，编号NMZ1。纯碱为生产废料，丙酮为天津市科密欧化学试剂有限公司生产，磷酸二氢钾、氯化钾、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠为天津市赢达稀贵化学试剂厂生产，以上试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

MGC-250型光照培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台，苏州净化设备有限公司；JA4103A(0.01 g)型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；DH-101-3型电热恒温鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司；HVE-50型高压蒸汽灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；PHSJ-5型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；U-5100分光光度计，日本 Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 螺旋藻培养

将螺旋藻NMZ1按照10%的接种量接种至250 mL的灭菌三角瓶中扩大培养，为后期试验提供材料。培养条件：光照周期12 h/12 h，温度32 ℃/28 ℃，pH为9.4，光照强度3 000 lx，每日早中晚各摇匀1次[6-7]。

1.3.2 螺旋藻藻蓝蛋白的测定

取螺旋藻液30 mL离心，将藻丝悬浮在20 mL浓度为0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液中(pH值为7.8)，然后放在-20 ℃冰箱中冷冻，反复冻融3次后，用超声波破碎仪破碎5 min，然后经6 000 r·min-1离心20 min，用722分光光度计测其D652和D615值，再根据公式C/(mg·L-1)=(D615-0.208×D652)/5.34计算得出藻蓝蛋白浓度[8-10]。

0.1 mol·L-1pH 7.8 磷酸缓冲液配置。甲溶液：磷酸氢二钠35.9 g 溶解后稀释至500 mL；乙溶液：磷酸二氢钠2.76 g 溶解后稀释至100 mL；甲91.5 mL，乙8.5 mL混合。

1.3.3 单因素试验

培养基中含纯碱生产废料、硝酸钠、氯化钾和磷酸二氢钾，其基本用量为纯碱生产废料8 g、硝酸钠1 g、氯化钾0.5 g和磷酸二氢钾0.5 g，依次改变其中一个组分的用量，其余3个组分的用量不变，配置半合成培养基。将对数期的螺旋藻接种到培养基中，将起始D560调至0.1，然后将其放入智能光照培养箱进行恒温培养，测定螺旋藻藻蓝蛋白的含量，进行单因素试验，重复3次，取平均值。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，选取纯碱生产废料、磷酸二氢钾、氯化钾和硝酸钠作为4个影响因素，采用Box-Behnken原理[11-14]，设计四因素三水平的响应面分析试验，共进行29组试验，中心试验重复5 次，数据用Design Expert软件分析确定培养基最佳配方。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纯碱生产废料对螺旋藻生长的影响

保持其他条件不变，分别测定在纯碱生产废料为4、8、12、16、20 g时螺旋藻藻蓝蛋白的含量，结果见图1-A。由图1-A可知，随着纯碱生产废料的增多，螺旋藻藻蓝蛋白的含量呈现出先增大后减小的趋势，并在纯碱生产废料使用量为16 g时达到最高。

2.1.2 硝酸钠对螺旋藻生长的影响

保持其他条件不变，分别测定在硝酸钠为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g时螺旋藻藻蓝蛋白的含量，结果见图1-B。由图1-B可知，螺旋藻藻蓝蛋白的含量呈现先增加后减小的趋势，以硝酸钠使用量为2.0 g时最高。

2.1.3 氯化钾对螺旋藻生长的影响

在其他条件不变的情况下，分别测定在氯化钾为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g时螺旋藻藻蓝蛋白的含量，结果见图1-C。从图1-C可以看出，螺旋藻藻蓝蛋白的含量在氯化钾添加量为1.0 g时达到最高。

2.1.4 磷酸二氢钾对螺旋藻生长的影响

在其他条件不变的情况下，分别测定在磷酸二氢钾为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g时螺旋藻藻蓝蛋白的含量，结果见图1-D。从图1-D可以看出，随着磷酸二氢钾的增加，螺旋藻藻蓝蛋白的含量呈现先增加后减少的趋势，在磷酸二氢钾为1.5 g时最高。

通过SPSS处理单因素实验结果，发现纯碱生产废料、硝酸钠、氯化钾和磷酸二氢钾的含量变化都显著影响螺旋藻藻蓝蛋白的含量，结果如表1所示。

2.2 响应面试验设计及结果分析

根据响应面法的设计原理，再结合单因素实验的结果，确定了4个因素的水平取值，如表2所示。根据表2设定的水平和因素，以A(纯碱生产废料)、B(硝酸钠)、C(氯化钾)和D(磷酸二氢钾)为自变量，螺旋藻藻蓝蛋白含量(Y)为响应值。

图1 纯碱生产废料、硝酸钠、氯化钾和磷酸二氢钾对螺旋藻藻蓝蛋白含量的影响Fig.1 Effect of soda ash production wastes， NaNO3， KCl and KH2PO4 on phycocyanin content of Spirulina

表1 单因素实验的方差分析

Table 1 Analysis of variance for single factor

因素Factor离差平方和SumofSquaresofdeviations均方差meansquareerrorF值FvalueP值Pvalue显著性Significance纯碱生产废料Sodaashproductionwastes80.0022062.7980**NaNO3277.76569.44152.7180**KCl67.52416.88113.1050.007**KH2PO4261.59665.39916.3660**

*表示在P<0.05水平时差异显著；**表示在P<0.01水平时差异极显著。下同。

*Means the difference is significant at the 0.05 level， ** means the difference is significant at the 0.01 level. The same as below.

表2 响应面因素及水平

Table 2 Factors and levels in the response surface design

因素Factor水平Level-101A—纯碱生产废料Sodaashproductionwastes/g121620B—NaNO3/g1.52.02.5C—KCl/g0.51.01.5D—KH2PO4/g1.01.52.0

按表2实施29次试验，并得到各个试验条件的螺旋藻藻蓝蛋白含量，结果如表3所示。由表3可知，螺旋藻藻蓝蛋白最大值在实验选取的中心点中(试验号12)，因此优化实验不用进行最陡爬坡路径逼近最大响应区域。

利用Design-Expert软件对试验结果进行拟合，得到回归方程：

Y=0.27+0.045A-0.00233B+0.009C+0.0076×10-4D-0.0034AB+0.008AC+0.0065AD+0.019BC-0.002BD-0.0005CD-0.071A2-0.0036B2-0.043C2-0.042D2

在回归方程中，A、C、D变量的正系数表明，该变量的正向变化能引起响应值的增加，B变量的负系数表明，该变量的负向变化能引起响应值的增加，负的二次项系数表明，方程的抛物面开口朝下，具有极大值点，可以进行最优分析。

对上述回归模型进行方差分析，结果如表4。由表4可知，模型极显著(P<0.000 1)，即方程在统计学上是有意义的。失拟项不显著(P=0.051 9>0.05)，说明实验误差很小，模型与实验拟合情况良好。模型的R2= 0.996 1，说明响应值有99.61%来自所选自变量，只有0.39%的试验不能用此方程确定，进一步说明此方程可用来进行螺旋藻藻蓝蛋白含量的预测和分析。回归方程各项的方差分析结果表明，方程的一次项A、C、D对螺旋藻藻蓝蛋白的含量有极显著的影响，B影响不显著，从F值可以看出，单因素对螺旋藻藻蓝蛋白含量影响的大小顺序是：纯碱生产废料>氯化钾>磷酸二氢钾>硝酸钠。方程的交互项AC、AD、BC及二次项A2、B2、C2、D2均对螺旋藻藻蓝蛋白的含量有极显著的影响，其余交互项的影响均不显著，表明各因素对螺旋藻藻蓝蛋白含量的影响不是简单的线性关系。

表3 响应面试验方案及结果

Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

试验号TestnumberA纯碱生产废料SodaashproductionwastesB硝酸钠NaNO3C氯化钾KClD磷酸二氢钾KH2PO4藻蓝蛋白Phycocyanincontent/(mg·L-1)1-10010.111420-1-100.1995301-100.1562400-1-10.16635-100-10.1087610010.209170-1100.17818-1-1000.1091900000.26911011000.20481100-110.17691200000.2641130-10-10.17991401100.211515001-10.18751600000.264217-10-100.1052180-1010.20371910-100.17902000000.265221-10100.105422-11000.11932310100.211924100-10.180525010-10.1708261-1000.20812700110.19612800000.26442901010.1879

表4 回归方程的方差分析

Table 4 Analysis variance of regression equation

来源source平方和Sumofsquares自由度df方差varianceF值FvalueP值Pvalue显著性Significance模型0.071140.0051255.9<0.0001**A0.02410.0241196.07<0.0001**B6.487×10-516.487×10-53.260.0925C0.000910.000948.33<0.0001**D0.000710.000735<0.0001**AB4.556×10-514.556×10-52.290.1524AC0.000310.000313.440.0025**AD0.000210.00028.430.0116**BC0.001510.001573.94<0.0001**BD1.122×10-511.122×10-50.560.465CD1×10-611×10-60.050.8258A20.03210.0321625.12<0.0001**B20.008410.0084423.63<0.0001**C20.01210.012601.71<0.0001**D20.01210.012583.64<0.0001**残差Residual0.0003141.99×10-5失拟项Lackoffit0.0003102.606×10-55.840.0519纯误差Pureerror1.786×10-544.465×10-6总和Overallerror0.07228

图2 螺旋藻藻蓝蛋白含量的预测值和真实值之间的程度拟合曲线Fig.2 The degree of fitting curve between predicted values and actual values for phycocyanin content

含量的预测值和真实值均接近于对角线，说明二者拟合程度好，模型的可靠性高。

2.3 响应面分析

响应面图是响应值在各个试验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面[15-17]。为了进一步分析纯碱生产废料、硝酸钠、氯化钾和磷酸二氢钾对响应值的作用，固定其中两个因素，使其处于中心水平，绘制另外两个因素交互作用的响应面和等高线图，对各因素之间的交互作用进行可视化分析，图3～图5是对响应值螺旋藻藻蓝蛋白影响较大的两因素交互作用的结果，其他因素交互作用不显著。

响应曲面的坡度变化及等高线的形状及紧密程度可以反映因子之间的交互作用，响应曲面坡度的平缓与陡峭程度，表明培养基含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白的响应灵敏程度[18-19]。等高线的形状为椭圆形，表示两个因素交互作用显著，为圆形则表示两个因素交互作用不显著，等高线密度大小表示两个因素交互作用强弱，密度大交互作用强，密度小交互作用弱[20]。图3～图5中等高线均呈椭圆状，故两因素交互作用显著。由图3可知，氯化钾含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白的影响相对较小，表现为响应面的坡度较缓和等高线较稀疏，纯碱生产废料含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白影响较大，表现为响应面的坡度陡峭和等高线较密集；由图4可知，纯碱生产废料含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白影响较大，表现为响应面的坡度较陡和等高线较密集，磷酸二氢钾含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白影响较小，表现为响应面的坡度较缓和等高线较稀疏；从图5可以看出，氯化钾含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白影响较大，表现为响应面的坡度较陡和等高线较密集。

图3 纯碱生产废料和氯化钾对螺旋藻藻蓝蛋白含量交互作用的响应面和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots for interaction of soda ash production wastes and KCl on phycocyanin content

图4 纯碱生产废料和磷酸二氢钾对螺旋藻藻蓝蛋白含量交互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for interaction of soda ash production wastes and KH2PO4 on phycocyanin content

2.4 验证试验

通过回归模型预测，给出的螺旋藻培养基最佳配方为纯碱生产废料17.32 g、硝酸钠1.99 g、氯化钾1.07 g、磷酸二氢钾1.56 g，在此条件下螺旋藻藻蓝蛋白的预测值为0.273 7 mg·L-1。考虑到实验的可操作性，最佳配方修正为，纯碱生产废料17 g、硝酸钠2 g、氯化钾1 g、磷酸二氢钾1.6 g，进行3次平行验证实验，螺旋藻藻蓝蛋白实际含量为0.269 3 mg·L-1，与预测值相比无明显差异，说明曲面响应分析所得的模型是可靠的。

3 结论与讨论

作为一种微生物，螺旋藻培养产率低、成本高、价格高，长期以来一直处于高端消费品行业，其丰富的营养物质是目前任何单一动物源、植物源及微生物源食物无法比拟的[14]。本试验对内蒙古东胜螺旋藻养殖基地的半合成培养基进行优化，以提高螺旋藻的产量和质量。在单因素实验基础上，利用响应面法对螺旋藻培养基进行优化，建立了纯碱生产废料、硝酸钠、氯化钾和磷酸二氢钾含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白含量的二次回归方程模型。通过回归模型方差分析得知，纯碱生产废料、氯化钾和磷酸二氢钾含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白含量影响极显著，硝酸钠含量变化对螺旋藻藻蓝蛋白含量影响不显著。通过响应曲面和等高线图的直观分析可知，纯碱生产废料和氯化钾、纯碱生产废料和磷酸二氢钾、氯化钾和硝酸钠的交互作用对响应值影响最显著，其他因素交互作用的影响不明显。结合单因素实验和响应面优化模型确定螺旋藻培养基的最佳配方为：纯碱生产废料17 g、硝酸钠2 g、氯化钾1 g、磷酸二氢钾1.6 g。目前，螺旋藻室外养殖半合成培养的各组分含量是纯碱生产废料8 g、硝酸钠1 g、氯化钾0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g，螺旋藻藻蓝蛋白含量为0.219 1 mg·L-1，经响应面优化后各组分含量均增加，螺旋藻含量达到0.269 3 mg·L-1，藻蓝蛋白含量提高了23%。利用数理统计方法优化螺旋藻培养基已有一些报道，田华等[21]采用正交试验对合成培养基进行了优化，使螺旋藻的干质量达到1.61 g·L-1，谯顺彬等[14]采用响应面法优化螺旋藻合成培养基，使螺旋藻干质量达到1.82 g·L-1，本研究用优化后的半合成培养基培养螺旋藻，发现螺旋藻的干质量达到了1.98 g·L-1，比报道的螺旋藻干质量提高8.7%～22.9%。本试验以内蒙古东胜螺旋藻养殖基地的经验配方为基础，采用响应面法对该配方主要成分的用量进行优化，结果表明，采用优化后的培养基培养螺旋藻，其养殖产量和质量都有所提高。

图5 氯化钾和硝酸钠对螺旋藻藻蓝蛋白含量交互作用的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for interaction of KCl and NaNO3 on phycocyanin content

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(责任编辑 张 韵)

Optimization ofSpirulinamedia by response surface methodology

XIE Lidan， WANG Suying*

(TianjinKeyLaboratoryofFoodBiotechnology，CollegeofBiotechnologyandFoodScience，TianjinUniversityofCommerce，Tianjin300400，China)

To optimize the basic formula ofSpirulinamedium，the effects of soda ash production wastes， sodium nitrate(NaNO3)， potassium chloride (KCl)， potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) on the phycocyanin content ofSpirulinawere determined using the response surface methodology (RSM) . Results showed that the optimal formula ofSpirulinamedium was soda ash production wastes 17 g， NaNO32 g， KCl 1 g， KH2PO41.6 g， which can achieve 0.269 3 mg·L-1phycocyanin， 23% higher than that of the semi-synthetic medium used in outdoor cultivation.

Spirulina; response surface; medium optimization; phycocyanin

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.18

2016-09-09

国家自然科学基金项目(31270050)；天津市高等学校创新团队(TD12-5049)

谢丽丹(1992—)，女，山西运城人，硕士，从事微生物资源前期开发研究。E-mail: 13820159533@163.com

*通信作者，王素英，E-mail: wsying@tjcu.edu.cn

Q179.1

A

1004-1524(2017)02-0307-08