A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC结构分析与生物学活性鉴定

许崇利，许崇波，宫语晨

(1.吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林132022； 2.韶关学院 英东生命科学院，粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关512005； 3.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC结构分析与生物学活性鉴定

许崇利1，许崇波2，*，宫语晨3

(1.吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林132022； 2.韶关学院 英东生命科学院，粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关512005； 3.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

利用PCR扩增技术克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，构建含PLC1-250基因表达质粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重组菌株，序列分析和酶切鉴定证实构建的pN-PLC1-250重组质粒含有目的基因且基因序列与阅读框架均正确。SDS-PAGE分析表明，PLC1-250蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的18.76%。利用SOPMA法预测PLC1-250蛋白分子的二级结构，且同源模建了其3D结构，结果表明，PLC1-250蛋白分子的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲，三级结构与α毒素相类似。此外，还对其生物学活性进行了鉴定，可为进一步探索α毒素作用的分子机制，以及其分子结构与生物学功能的关系奠定基础。

A型魏氏梭菌；α毒素PLC基因；生物学活性；圆二色光谱

A型魏氏梭菌(Clostridiumwelchiitype A)是引起人类食物中毒、气性坏疽和肠毒血症等肠道性疾病的主要病原菌，其分泌的α毒素由370个氨基酸组成，是A型魏氏梭菌主要的致病因子。α毒素具有溶血性、细胞毒性、皮肤坏死性和致死性等生物学特性[1-2]。研究表明，α毒素氨基端具有磷脂酶C(PLC)活性，可水解细胞膜的主要成分——磷脂酰胆碱。α毒素羧基端对于α毒素氨基端的生物学活性具有重要影响，其结构域对于α毒素结合细胞膜至关重要[3-4]。晶体结构分析表明，α毒素的酶活性部位包括催化位点和结合位点，其结构包括由9个α螺旋和1个活性位点组成的氨基端和由8个反平行的β折叠组成的羧基端[5]。α毒素的酶活性依赖于金属离子Zn2+，主要结合位点是第56位的天冬氨酸，同时该位点也是其催化位点。Nagahama等[6]利用定点突变技术证实α毒素的某些氨基酸残基会影响其生物学活性。Stevens等[7]和Nagahama等[8-9]构建了1～249氨基酸的α毒素氨基端，该片段保留了磷脂酶C活性。这些研究虽然证实α毒素氨基端具有磷脂酶C活性，但对于α毒素分子结构与生物学活性之间的关系并未进行深入的研究。本研究拟对α毒素氨基端PLC1-250基因进行表达，预测其蛋白二级结构，同源模建其3D结构，并测定PLC1-250蛋白的圆二色光谱，探索PLC1-250蛋白的生物学活性，以期为进一步研究α毒素分子结构与生物学功能的关系及其分子作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体和菌株

BL21(DE3)菌株和pET-32a购自Novagen公司；重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)由韶关学院许崇波教授惠赠；活性检测用的小鼠购自吉林大学实验动物中心。

1.2 试剂

QDL2000 DNA分子量标记、ExTaq酶、T4DNA连接酶、限制性核酸内切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ)和IPTG购自宝生物工程有限公司；氨苄西林(Amp)和卡那霉素购自Sigma公司；Wizard PCR preps DNA Purification System购自Promega公司。

1.3 表达质粒pN-PLC1-250的构建

根据Titball等[10]报道的PLC1-250基因序列设计PCR扩增引物并合成，引物序列为：上游引物P1，5′-CATGCCATGGCATGGGATGGAAAGATTGAT-3′，下游引物P2，5′-CCGGAATTCTGATGGATCATTACCCTC-3′。上游引物和下游引物分别含EcoRⅠ和NcoⅠ的酶切位点及保护性碱基。利用这对PCR引物从重组质粒pXETA02扩增出α毒素氨基端PLC1-250基因片段。参照文献[11]的方法，NcoⅠ和EcoRⅠ分别酶切PCR产物和pET-32a载体，16 ℃ T4DNA连接酶连接过夜。随后将连接产物转化至感受态细胞BL21(DE3)中，利用Amp抗性筛选出阳性克隆，提取重组表达质粒pN-PLC1-250，并进行酶切鉴定和测序。

1.4 pN-PLC1-250表达及SDS-PAGE分析

按文献[11]报道的方法进行。

1.5 α毒素和PLC1-250蛋白二级结构预测

按Geourjon等[12]介绍的方法，在EXPASY服务器(http://www. expasy. org/ tools)上利用SOPMA法预测α毒素和PLC1-250蛋白二级结构。

1.6 α毒素和PLC1-250蛋白3D结构预测

以蛋白质结构数据库(PDB)提供的α毒素三维结晶结构(3D)为模板，使用EXPASY服务器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)对α毒素和PLC1-250蛋白3D结构进行同源模型构建，并用Rasmol软件绘制其3D结构图[13]。

1.7 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圆二色谱分析

使用J810-150S型圆二色谱仪测定α毒素和PLC1-250蛋白的CD光谱，并记录数据[14]。

1.8 PLC1-250蛋白生物学活性测定

将A型魏氏梭菌标准株C57-1的培养上清液和重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的菌体、菌体裂解物和上清液分别接种于卵黄琼脂平板和血琼脂平板，观察是否具有磷脂酶C活性和溶血活性[15]。将100 μL含卵磷脂的卵黄稀释液分别加入3只Eppendorf管，再分别加入100 μL生理盐水、PLC1-250蛋白和α毒素进行混匀，37 ℃恒温孵育24 h，通过观察浑浊环出现与否来检测是否具有磷脂酶C活性[16]。另取80只小鼠分为4组，每组20只，将A型魏氏梭菌标准株C57-1和5×109个重组菌株BL21(DE3) (pN -PLC1-250)经口服或腹腔注射到小鼠体内，观察临床症状并进行病理检测[17]。

2 结果与分析

2.1 pN-PLC1-250重组表达质粒的构建与鉴定

利用PCR扩增技术，以pXETA02质粒为模板，扩增出α毒素氨基端0.75 kb的PLC1-250基因，NcoⅠ和EcoRⅠ分别酶切PCR产物和pET-32a载体，连接后转化至BL21(DE3)中，构建含PLC1-250基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)，提取重组质粒pN-PLC1-250，并用限制性核酸内切酶NcoⅠ/EcoRⅠ进行酶切鉴定，结果证实重组质粒pN-PLC1-250含有PLC1-250基因，核苷酸序列分析表明其基因序列和阅读框架均正确(图1)。

2.2PLC1-250基因表达产物的SDS-PAGE分析

重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)IPTG诱导4 h后取样，进行SDS-PAGE分析。结果表明，PLC1-250基因在BL21(DE3)宿主菌中得以表达，经凝胶成像仪扫描分析，PLC1-250蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的18.76%(图2)。

2.3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二级结构预测

应用EXPASY服务器(http://www. expasy.org/ tools)上的SOPMA法预测α毒素和PLC1-250蛋白分子的二级结构(图3)。α毒素蛋白中：α螺旋118个，占31.9%；β折叠78个，占21.1%；β转角44个，占11.9%；无规则卷曲130个，占35.1%。PLC1-250蛋白中：α螺旋97个，占38.8%；β折叠42个，占16.8%；β转角36个，占14.4%；无规则卷曲75个，占30.0%。预测结果表明，PLC1-250蛋白分子的二级结构与α毒素氨基端部分的二级结构相比发生了一些变化，其二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲，二者共占68.8%。

M，DL2000 DNA分子量标准；1，pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠM， DL2000 DNA marker; 1， pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠ图1 重组质粒pN-PLC1-250酶切鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pN-PLC1-250 by enzyme digestion

M，低分子量蛋白标记；1，BL21(DE3)(pET-32a)全菌体；2，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)全菌体；3，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)包涵体M， Low molecular protein marker; 1， Total cell lysate of BL21(DE3)(pET-32a); 2， Total cell lysate of BL21(DE3)(pN-PLC1-250); 3， The inclusion bodies of BL21(DE3)(pN-PLC1-250)图2 PLC1-250基因表达产物SDS-PAGE结果Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant strain BL21(DE3)(pN-PLC1-250)

2.4 α毒素和PLC1-250蛋白分子的3D结构预测

以蛋白质结构数据库(PDB)提供的α毒素的三维结晶结构(3D)作为模板，利用EXPASY服务器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)对α毒素和PLC1-250蛋白3D结构进行同源模型构建，并用Rasmol软件绘制其3D结构图。结果显示，α毒素蛋白共有9段α螺旋和8段β折叠，PLC1-250蛋白3D结构也包括9段α螺旋，与α毒素蛋白氨基端部分的3D结构相类似(图4)。

2.5 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圆二色谱分析

借助圆二色谱仪测定α毒素和PLC1-250蛋白分子的CD光谱(图5、表1)，结果显示，二者的CD光谱相类似。

h，α螺旋； e，β折叠； t，β转角； c，无规则卷曲h， alpha helix; e， beta extended strand; t， beta turn; c， random coil图3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二级结构预测及比较Fig.3 Prediction and comparison of the second structure of α-toxin and PLC1-250 protein

2.6 重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)生物学活性测定

A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清液和重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培养上清液及菌体培养物在卵黄琼脂平板上均出现了特征性浑浊环，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌体裂解物并没有出现特征性浑浊环，这说明PLC1-250是以分泌形式表达的，并且能分解卵黄琼脂平板中的卵磷脂。磷脂酶C活性检测结果显示(图6)：出现浑浊环的1号和2号管均能分解卵黄中的卵磷脂。上述结果表明，PLC1-250蛋白与α毒素一样具有磷脂酶C活性。

在血琼脂平板上，A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清出现了溶血环，而重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培养上清液、菌体培养物及菌体裂解物均没出现溶血环，表明PLC1-250表达产物不具备α毒素的溶血活性。口服和腹腔注射重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的小鼠(试验组)，观察3周后没有出现临床症状，且剖检后组织学检查显示，无病理变化(图7)，表明重组菌株BL21(DE3) (pN-PLC1-250)已经没有致病性，而对照组(A型魏氏梭菌标准株C57-1)则出现明显的临床症状，且剖检后组织学检查显示，发生病理变化(图8)。

图4 α 毒素(A)和PLC1-250蛋白(B)分子3D结构预测Fig.4 Prediction of the three-dimensional structure (3D) of α-toxin (A) and PLC1-250 protein(B)

图5 α毒素(A)和PLC1-250蛋白分子(B)的圆二色谱图Fig.5 Circular dichroism (CD) spectrum of α-toxin (A) and PLC1-250 protein (B)

表1 圆二色谱测定的α毒素和PLC1-250蛋白分子二级结构成分比较

Table 1 Comparison of secondary structure elements of α-toxin and PLC1-250 protein based on circular dichroism spectrum

成分Elementα毒素α-toxin氨基配数量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α毒素氨基端PLC1-250蛋白PLC1-250ofα-toxinamino-termi-nal氨基配数量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α-螺旋Alphahelix12032.59839.2β-折叠Betaextendedstrand7620.53815.2β-转角Betaturn4311.63815.2随机卷曲Randomcoil13135.47630.4

1， α毒素； 2， PLC1-250蛋白； 3， 生理盐水1， α-toxin; 2， PLC1-250 protein; 3， Physiological saline water图6 α毒素和PLC1-250蛋白的磷脂酶C活性检测Fig.6 Detection of phosphalipase C activity of α-toxin and PLC1-250

3 小结

本研究利用PCR扩增技术克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，构建起含PLC1-250基因表达质粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重组菌株，经序列分析和酶切鉴定，证实所构建的pN-PLC1-250重组质粒含有目的基因，且基因序列与阅读框架均正确。利用SOPMA法预测PLC1-250蛋白分子的二级结构，同源模建其3D结构，结果表明，PLC1-250蛋白分子的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲，三级结构与α毒素相类似。对PLC1-250蛋白的生物学活性进行鉴定，结果显示，重组菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培养上清液及菌体培养物在卵黄琼脂平板上均出现了特征性浑浊环，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌体裂解物并没有出现特征性浑浊环，这说明PLC1-250是以分泌形式表达的，并且能分解卵黄琼脂平板中的卵磷脂，即PLC1-250蛋白与α毒素一样具有磷脂酶C活性。小鼠试验结果表明，PLC1-250蛋白没有溶血活性及致病性。这些工作为今后深入探索α毒素作用的分子机制，以及其分子结构与生物学功能的关系奠定了基础。

A， 空肠； B， 肝脏； C， 肺脏； D， 心脏。图8同A， Jejunum; B， Liver; C， Lung; D， Heart. The same as in Fig. 8图7 试验组小鼠组织学检查结果Fig.7 Histological examination results of mice in the experimental group

图8 对照组小鼠组织学检查结果Fig.8 Histological examination results of mice in the control group

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(责任编辑 高 峻)

Structural analysis and identification of biological activity of alpha-toxin amino-terminal PLC fromClostridiumwelchiitype A

XU Chongli1， XU Chongbo2，*， GONG Yuchen3

(1.CollegeofBiologyandFoodEngineering，JilinInstituteofChemicalTechnology，Jilin132022，China; 2.NorthGuangdongCollaborativeInnovationandDevelopmentCenterforSwineFarmingandDiseaseControl，YingdongCollegeofLifeSciences，ShaoguanUniversity，Shaoguan512005，China; 3.CollegeofAnimalScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Amino-terminalPLC1-250 gene ofClostridiumwelchiiα-toxin was amplified by PCR. The recombinant strain BL21 (DE3)(pN-PLC1-250) containingPLC1-250 gene was constructed. It was shown that the recombinant plasmid pN-PLC1-250 containedPLC1-250 gene with correct sequence and ORF by identification of endonuclease-digesting and sequence analysis. SDS-PAGE analysis showed that the expression level of PLC1-250 proteins were about 18.76% of total cellular proteins. The secondary structure and three-dimensional structure of PLC1-250 proteins were predicted by SOPMA method on EXPASY website. The results showed that the secondary structure of PLC1-250 protein was composed of alpha helices and random coils. The three-dimensional structure of PLC1-250 protein was similar with amino-terminal domain of α-toxin protein. The study of biological activity laid foundation for further research of the molecular mechanism of α-toxin and the relation of its molecular structure and biological function.

Clostridiumwelchiitype A; alpha-toxinPLC-gene; biological activity; circular dichroism spectra

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.06

2016-09-26

吉林省教育厅“十三五”科学研究规划项目(2016138)

许崇利(1974—)，男，黑龙江鸡东人，博士，教授，研究方向为微生物分子生物学。E-mail: xcl902@163.com

*通信作者，许崇波，E-mail: xcb902@163.com

S852；Q78

A

1004-1524(2017)02-0213-07