产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的检测及感染现状

刘希华，钟太清，朱元琪，苏维奇*

(1.海军青岛第二疗养院 感控科，山东 青岛266071；2.青岛大学附属青岛市立医院 检验科；3. 青岛大学附属医院 检验科)

*通讯作者

产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的检测及感染现状

刘希华1，钟太清2，朱元琪3，苏维奇2*

(1.海军青岛第二疗养院 感控科，山东 青岛266071；2.青岛大学附属青岛市立医院 检验科；3. 青岛大学附属医院 检验科)

目的 通过对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的检测及病例分析，了解CRKP对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制及感染现状，为临床抗感染治疗及院感控制提供依据。方法 应用BD phoenixTM-100 全自动细菌鉴定及药敏分析系统筛选耐亚胺培南或美罗培南的肺炎克雷伯菌，然后通过改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型，用PCR方法检测KPC、NDM-1和OXA-48碳青霉烯酶耐药基因。结果 71株CRKP改良Hodge试验阳性56株，阳性率为78.9%，PCR结果显示：71株CRKP中有53株检测出blaKPC-2基因、8株blaNDM-1基因、2株blaOXA-48基因；标本来源主要见于ICU、肾内科和神经内科等病房的痰液、尿液和引流液标本；药敏结果显示：所分离的71株CRKP除了对阿米卡星、替加环素和多粘菌素的耐药率较低外，对其他抗菌药物的耐药率均>70%。 结论 CRKP临床分布较为广泛，多药耐药严重，其耐药基因以产KPC-2型为主，但同时还出现了NDM-1和OXA-48基因型，应加强监控。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐药；感染

(ChinJLabDiagn,2017,21:0225)

碳青霉烯类抗菌药物因其具有抗菌谱广、抗菌活性高等特点，被认为是治疗革兰阴性杆菌最有效的药物之一。然而，随着临床上该类药物的广泛应用甚至是不合理使用等原因，导致耐碳青霉烯类抗菌药物的细菌种类及检出率逐渐增多，特别是碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的产生，不仅其耐药范围广泛，而且可引起医院内的暴发流行[1]，给临床抗感染治疗带来了很大困难，已成为全球共同关注的社会卫生问题。本文对近三年来收集的71株CRKP的耐药性及耐药基因进行检测，探讨CRKP的耐药机制及感染现状，为临床抗感染治疗以及医院内感染的控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集本地区2013年1月-2015年12月青岛大学附属医院、青岛市市立医院临床分离的CRKP共71株。

1.2 主要仪器和试剂 美国BD公司phoenixTM-100 全自动细菌鉴定及药敏分析系统及配套试剂；美国Bio-Rad公司PCR扩增仪、全凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 细菌鉴定及药敏试验 所有菌株均采用美国BD公司phoenixTM-100 全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行检测，结果判定依据美国临床实验室标准化研究所(CLSI-2014)进行。质控菌株为：大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.2 碳青霉烯酶表型检测 采用改良Hodge试验，将大肠埃希菌ATCC 25922配制0.5麦氏浊度菌液，再稀释10倍，将稀释后的菌液用无菌棉签蘸取均匀涂布于M-H琼脂平皿上，干燥3-10 min，将美罗培南纸片贴于M-H琼脂平皿中央，用接种环挑取3-5个待测菌落，从纸片边缘垂直划线，长度约20-25 mm，孵育16-20 h观察结果，如果待测菌株与大肠埃希菌ATCC 25922抑菌圈交汇处呈矢状生长现象，即为产碳青霉烯酶。

1.3.3 碳青霉烯酶基因扩增 PCR扩增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因，参照文献[2]进行，扩增的反应体系、条件、基因引物和产物长度见表1和表2。

表1 PCR扩增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因引物和产物长度

表2 扩增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48反应体系及条件

2 结果

2.1 CRKP的临床分布及标本种类 71株CRKP主要分布于ICU、肾内科和神经内科等病房，分别占53.5%、11.3%和7.0%；标本种类主要见于痰液、尿液和穿刺引流液，分别占62.0%、16.9%和9.9%。

2.2 药敏试验结果 71株CRKP除了对阿米卡星、替加环素和多粘菌素的耐药率较低，分别为18.3%、11.3%和12.7%外，对其他临床常用抗菌药物如头孢菌素类、加酶抑制剂类、喹诺酮类以及碳青霉烯类等表现出高耐药性，耐药率均大于70%。改良Hodge试验 对筛选出的71株CRKP进行改良Hodge试验，阳性56株，阳性率为78.9%。

2.3 耐药基因检测结果 71株CRKP经PCR扩增及测序确认有53株为KPC-2型碳青霉烯酶，占74.6%；8株为NDM-1型酶，占11.3%；2株为OXA-48型酶，占0.03%，部分PCR扩增产物电泳图见图1。

注：M：DNA标准分子量；1-7：临床分离株；P：blakpc-2阳性对照；N：阴性对照

图1blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因多重PCR扩增产物电泳图

3 讨论

肺炎克雷伯菌是引起医院获得性感染和社区获得性感染的常见病原菌之一，常可引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染等。中国细菌耐药性监测网(CHINET)数据显示，2011年至2016年肺炎克雷伯菌的分离率一直位于第二位，其中CRKP的检出率由2011年的9%上升到2016年的19%，6年中检出率增加了1倍多，其上升速度较快，并且CRKP大多表现为多重耐药甚至是广泛耐药。目前，细菌耐碳青霉稀类药物的机制主要有：①产碳青霉烯酶，主要包括A类和B类，A类中最多见的是KPC型碳青霉烯酶，B类碳青霉烯酶即为金属酶，常见的有VIM、IPM以及近年报道的NDM-1型。②外膜蛋白的缺失联合产AmpC酶，③药物作用靶位的改变和药物外排机制等。KPC酶是近年发现的一种新型碳青霉烯酶，目前已发现有5个KPC亚型，国内KPC酶主要为KPC-2型[3.4]，而李天骄[5]报道的海南省海口地区碳青霉烯酶主要为金属酶，说明碳青霉烯酶基因型存在着地区差异，不同地区不同医院可有不同的基因型。本试验在71株CRKP中，共检测出53株为KPC-2型碳青霉烯酶，占74.6%；8株为NDM-1型酶，占11.3%；2株为OXA-48型酶，占0.03%，其中还发现同时携带 blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的肺炎克雷伯菌临床株[10]，应引起高度重视。

改良的Hodge试验敏感度较高，可用于对疑是产碳青霉烯酶细菌进行表型确证，但是，杨启文[6]和Pasteran[7]等认为改良的Hodge试验虽然灵敏度高，但特异性尚显不足，可出现假阳性。其主要原因为出现假阳性的菌株产生了较多的ESBL或AmpC酶，影响了结果的判断，提醒实验室工作人员在实际工作中加以注意。

CRKP感染患者往往基础疾病较多，全身免疫力低下，目前尚无有效的治疗药物，因此CRKP感染已成为院内死亡的独立危险因素[8]。刘静娴[9]等报道的60名CRKP感染患者中，好转率仅有31.7%，直接死亡率达56.7%，另有11.6%的患者转院或放弃治疗。本试验中的71株CRKP主要来源于重症监护室、肾内科和神经内科的呼吸道、尿液和引流液等标本，可能与这些患者基础疾病严重、住院时间较长、使用大量抗菌药物及进行侵入性操作有关。

产KPC酶菌株不仅对碳青霉烯类抗菌药物耐药，同时可对头孢菌素类、喹诺酮类等多种抗菌药物广泛耐药。多重耐药甚至是泛耐药的CRKP感染是导致治疗失败和患者死亡的重要原因。本试验药敏结果显示，71株CRKP除了对阿米卡星、替加环素和多粘菌素的耐药率较低，分别为18.3%、11.3%和12.7%外，对其他临床常用抗菌药物如头孢菌素类、加酶抑制剂类、喹诺酮类以及碳青霉烯类等表现出高耐药性，耐药率均大于70%。因此实验室应做好检测工作，一旦确定碳氢酶烯类耐药的肠杆菌科细菌(CRE)，应作为危急值及时报告给临床和院感管理部门，并及时采取控制措施，以减缓耐药菌株的产生和传播。

[1] 赵 辉，贾 楠，徐 茶，等.产NDM-1肺炎克雷伯菌引起的新生儿感染及其同源性检测[J].中华医院感染学杂志，2016,26(10)：2357.

[2]Poirel L,Walsh TR,Cuvillier V,et al.Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J].Diagnostic microbiology and infectious disease,2011,70(1): 119.

[3]俞 刚，张 肖，沈 静，等.耐碳青霉稀类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1内酰胺酶耐药基因的研究[J].中国感染与化疗杂志，2014,14(1)：38.

[4]张翼霞，刘颖梅，陈宏斌，等.我国产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的基因型及流行病学研究[J].中华内科杂志，2014,53(2)：116.

[5]李天骄，王旭明，符生苗，等.海南产KPC-2型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的流行现状[J].广东医学，2014,35(14)：2204.

[6]杨启文，郑 瑞，王 辉，等.改良Hodge试验检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的性能评价[J].中华检验医学杂志，2010,33(12)：1122.

[7]Pasteran F,Mendez T,Rapoport M,et al.Controlling False-positive results obtained with the Hodge and Masuda assays for detection of class a carbapenemase in species of Enterobacteriaceae by incorporating boronic acid[J].J Clin Microbiol,2010,48(4):1323.

[8]Schwaber MJ,Klarfeld-Lidji S,Navon-Venezia S,et al.Predictors of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae acquistion among hosoitalized adults and effect of acquisition on mortality[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(3):1028.

[9]刘静娴，俞 静，李媛睿，等.肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制研究[J].上海交通大学学报 医学版,2016,36(1)：93.

[10]油丽萍，陈爱文，秦 萍，等.首例同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的肺炎克雷伯菌临床株[J].中国实验诊断学，2015,19(5)：744.

Detection of Klebsiella pneumoniae producing KPC carbapenemase and its infection status

LIUXi-hua,ZHONGTai-qing,ZHUYuan-qi,etal.

(NavyQingdaosecondnursinghomeInfectioncontrolsection,Qingdao266071,China)

Objective Detection and analysis of cases to carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP).Understanding the resistance mechanism and infection status of CRKP antibacterial to carbopenems.Provide the basis for the clinical anti infection treatment and hospital infection control.Methods The application of BD phoenixTM-100 automatic bacteria identification and drug sensitivity analysis system for screening of Klebsiella pneumoniae resistant to imipenem or meropenem,and then through the modified Hodge test for the detection of carbapenemases phenotype of carbapenems.KPC,NDM-1 and OXA-48 carbapenemase resistancegene detected by PCR.Results 71 strains of CRKP modified Hodge test,56 were positive,the positive rate was 78.9%.PCR showed that there were 53 strains in 71 strains CRKP detect blaKPC-2 gene,8 strains blaNDM-1,2 strains blaOXA-48 genes;Specimen source mainly in urine ,sputum and drainage fluid which from ICU,renal medicine and neurology ward.The drug sensitivity results showed that in addition to the low resistance to amikacin,tigecycline and polymyxin,71 strains of isolates were resistant to other antimicrobial agents>70%.Conclusion CRKP clinical distribution is more extensive,multi drug resistance is serious.Resistance gene is mainly produced KPC-2,NDM-1 and OXA-48 also appeared at the same time.We should strengthen the monitoring with them.

Klebsiella pneumoniae;Carbapenemases;drug resistance;infection

1007-4287(2017)02-0225-03

R446.5

A

2016-02-26)