抑制COX-2表达通过Akt/iNOS/NO信号通路发挥抗凋亡作用机制的研究

孙小婷,姜 曦,庞 磊,麻海春*

(吉林大学第一医院1.麻醉科;2.健康管理中心,吉林 长春130021)

抑制COX-2表达通过Akt/iNOS/NO信号通路发挥抗凋亡作用机制的研究

孙小婷1,姜 曦2,庞 磊1,麻海春1*

(吉林大学第一医院1.麻醉科;2.健康管理中心,吉林 长春130021)

目的 探讨心肌缺血/再灌注损伤过程中环氧化酶-2(COX-2)的表达水平与细胞凋亡之间联系及作用机制。方法 通过对心肌细胞进行缺氧/复氧(H/R)实验，模拟心肌缺血再灌注过程，检测COX-2及凋亡相关蛋白的表达水平；采用COX-2特异性抑制剂NS398对其活性进行抑制，观察细胞凋亡水平的变化，并研究其作用机制。结果 与对照组相比，在H/R组中，Bcl2表达明显减少，cleaved capase-3的表达明显增强；在NS398预处理后，cleaved caspase-3的表达明显减少，Bcl2表达增强，TUNEL试验结果提示，NS398预处理明显减少阳性细胞的比例。结论 在心肌细胞中，H/R刺激能够激活COX-2表达，并通过促凋亡途径导致细胞损伤；抑制COX-2活性能够激活Akt/iNOS/NO信号通路，并进而通过抗凋亡机制，发挥对心肌细胞的保护作用。

COX-2；心肌缺血/再灌注损伤；缺氧/复氧；心肌细胞；细胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:0290)

在心肌缺血过程中，细胞中环氧化酶(cyclooxygenase，COX)表达水平显著增高，且心肌梗死时细胞凋亡的严重程度与COX-2表达水平呈正相关，提示COX-2的表达可能与缺血性心肌病相关[1-3]。尽管文献报道在心肌缺血再灌注损伤(MI/ RI)的动物模型中，COX-2的表达具有心肌保护作用，但更多的报告倾向于COX-2表达的增强在MI/ RI中扮演有害角色[4-7]。在大鼠[4-6,8]、兔子[6]和狗[7]等动物模型中，采用COX-2特异性抑制剂对动物进行预处理后，动物的心功能明显提高，心肌梗死面积也有所下降[9]。本研究通过缺氧/复氧(hypoxia/ reoxygenation，H/ R)实验，模拟心肌缺血再灌注过程，分别在心肌细胞株H9C2细胞和原代大鼠心肌细胞中探究COX-2表达水平与Akt/iNOS/NO信号通路之间潜在联系及分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养与实验分组

细胞系H9C2购自American Type Culture Collection公司 (ATCC,Manassas,VA,USA)，大鼠心肌细胞的分离与培养方法详见文献[10]。分别将H9C2细胞与大鼠心肌细胞分别随机分为三组：对照组(CTL)、缺氧/复氧组(H/R组)和给药组(H/R +NS398组)。前期工作显示，采用10μM COX-2特异性抑制剂NS398对细胞预处理1小时能够明显抑制COX-2的活性。

1.2 MTT试验

培养基中的乳酸盐脱氢酶(LDH)水平是评估细胞损伤的重要指标[11]，采用LDH检测试剂盒(Cat.no.11644793001Roche,Mannheim,Germany)分别对H9C2细胞和大鼠心肌细胞的活力进行评估。

1.3 Western blot实验

分别提取各组中H9C2细胞和大鼠心肌细胞中的蛋白，通过western blot对其蛋白表达水平进行检测，所用抗体及其滴度如下：COX-2(1∶1000)、iNOS(1∶40)、GADPH (1∶1000)、总caspase-3 (1∶1000)、 cleaved caspase-3 (1∶1000)、Akt (1∶1000)、p-Akt (1∶1000)，各抗体购买公司请参见文献[10]。采用Image J软件对蛋白表达水平进行定量分析。1.4 TUNEL试验

将H9C2细胞接种在载玻片上，在经过不同处理之后，采用原位细胞凋亡检测试剂盒(Cat.no.11684817910,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)对其进行TUNEL染色，判定心肌细胞凋亡水平。

1.5 COX-2活性检测

采用COX荧光活性分析试剂盒(Cat.no.700200,Cayman)测定不同组别细胞中COX-2的活性。

1.6 测定细胞内一氧化氮(NO)含量

在有或无H/R刺激下，NS398 (10 μM 1小时) 或者 LY294002 (10 μM 1小时)[12]或者1400W (1μM 30分钟)[13]将H9C2细胞培养在96孔黑色的聚苯乙烯板上(Cat.no.3916,Corning Life Sciences)检测细胞内NO。

1.7 统计学分析

所有数据均以平均数±标准差表示，组间比较用Mann-Whitney U测试或者单向方差分析及Tukey’s后检验，使用GraphPad Prism 5.0软件进行做图，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 H/R介导的COX-2表达水平上升

在H/R后，实验组LDH释放明显增多，提示H/R心肌细胞损伤模型构建成功(图1A)，且实验组中COX-2的表达显著上升(图1B)。然而，在经过COX-2特异性抑制剂NS398预处理之后，LDH的释放明显减少(图2A)，细胞活力明显增强(图2B)。

图1A 在H/R后，LDH释放的比较( *P<0.05 CTL vs.H/R or H/R+Helenalin,#P<0.05 H/R vs.H/R+Helenalin)

图1B 在H9C2心肌细胞中，H/R后，COX-2表达的比较( *P<0.05 CTL vs.H/R or H/R+Helenalin,#P<0.05 H/R vs.H/R+Helenalin)

图2A 经过COX-2特异性抑制剂NS398预处理，LDH的释放比较(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

图2B 经过COX-2特异性抑制剂NS398预处理，细胞活力的比较(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

2.2 在H9C2细胞中，抑制COX-2活性能够减轻H/R介导的细胞凋亡

与对照组相比，在H/R组中，Bcl2表达明显减少，cleaved capase-3的表达明显增强。而在NS398预处理后，cleaved caspase-3的表达明显减少，Bcl2表达增强(图3A)。此外，TUNEL试验结果提示，NS398预处理明显减少阳性细胞的比例(图3B)。

图3A 在H9C2细胞中，cleaved caspase-3、Bcl2表达的比较(*P<0.05 CTL 图3B 在H9C2细胞中,荧光显微镜下阳性

vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05，H/R vs.H/R + NS398) 细胞的比例的比较(*P<0.05，CTLvs.H/R or H/R + NS398；#P<0.05，H/R vs.H/R + NS398)

2.3 成年大鼠心肌细胞中，COX-2参与了H/R介导的细胞损伤与凋亡

H/R明显增加了原代心肌细胞中LDH的释放，cleaved caspase-3的表达，并减弱了细胞活力(图4)。在NS398预处理之后，LDH的释放明显减少(图4A)，细胞活力增强(图4B)，cleaved caspase-3表达水平降低(图4C)。

图4 (A,B,C)在原代成年大鼠心肌细胞中，LDH的释放、cleaved caspase-3 表达、细胞活力的比较(*P<0.05 CTL vs.H/R,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

2.4 在H9C2细胞中，抑制COX-2活性能够激活Akt/iNOS/NO信号通路

结果显示，NS398预处理后，p-Akt表达水平显著提高(图5A)。在LY294002预处理后，p-Akt的表达受到了明显的抑制(图5A)，并失去了对心肌的保护作用，即LDH释放增多、cleaved caspase-3水平上升、细胞活力减弱(图5A,B,C)。同H/R组相比，H/R+NS398组中检测到了高浓度的NO，而这一过程能够被LY294002抑制(图5D)。在H/R+NS398组中，cleaved caspase-3蛋白水平上升，LDH释放增多，细胞活力减弱，细胞内NO水平受到明显抑制。

图5(A) 总Akt、p-Akt、cleaved caspase-3、iNOS表达水平的比较(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398 or H/R+NS398+LY294002,#P<0.05 H/R vs.H/R+NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs.H/R+NS398+LY294002)

图5(B) LDH释放水平的比较((*P< 图5(C,D) 细胞活力、NO浓度的比较((*P<0.05 CTLvs.H/R or H/R+0.05 CTL vs.H/R or H/R+ NS398 or H/R+NS398+LY294002,#P<0.05 H/R vs.H/RNS398 or H/R+NS398+LY +NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs.H/R+NS398+LY294002)294002,#P<0.05 H/R vs.H/R+NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs H/R+NS398+LY294002)

3 讨论

在生理条件下，组织中的COX-2表达水平很低或不表达，前期研究结果显示在不同的心肌缺血再灌注动物模型中，COX-2选择性抑制剂处理可以明显增强心功能，并且减少心肌梗死的面积[4-7]。这一结论与我们在细胞模型实验中的发现一致，然而目前为止，并没有研究阐述抑制COX-2活性是通过何种途径发挥心肌保护作用的。在本研究中，我们通过H/ R实验，模拟心肌缺血再灌注过程，并采用COX-2特异性抑制剂NS398分别作用于H9C2细胞和原始成年大鼠心肌细胞，对其COX-2活性进行特异性抑制，结果显示，抑制COX-2活性能够明显缓解H/R所介导的细胞损伤，如LDH释放量增多、细胞活力下降等。

细胞凋亡主要包括内源性和外源性两种途径[14]。在内源性途径中，当细胞感受到刺激时，促凋亡蛋白(如Bax)破坏线粒体膜结构的完整性，导致线粒体功能障碍和细胞色素的释放，然而抗凋亡蛋白(如Bcl2)则可通过干扰促凋亡细胞聚集来阻止细胞凋亡进程[15,16]。在外源性途径中，配体与细胞表面凋亡受体相结合，形成凋亡复合体并且激活caspase-8和caspase-10，它们能够裂解caspase-3，聚集外源性和内源性半胱天冬酶级联反应[8,14]。研究表明H/R刺激可以通过内源性和外源性途径诱导心肌细胞凋亡[8,17,18]，然而心肌细胞受H/R刺激的作用时间不同可能引发不同的凋亡途径。在本研究中，在H/R组中，Bcl2表达明显减少，cleaved capase-3的表达明显增强，这些结果提示H/R刺激可能分别通过内源性和外源性两条途径诱导心肌细胞凋亡。值得注意的是，在H/R刺激下Bax表达水平并没有发生变化，这可能归因于目前实验设置中特异的H/R条件(6小时缺氧和12小时复氧)。采用COX-2特异性抑制剂NS398对细胞进行预处理能明显的减少H/R刺激所介导的上述不良事件，以上结果提示，抑制COX-2活性可能是通过减少细胞凋亡来减轻H/R所介导的细胞损伤。

紧接着我们研究了抑制COX-2是如何减少H/R所介导的细胞凋亡的。Akt信号通路在调控心肌细胞存活与凋亡中扮演重要角色[19]。在本研究中，H/R刺激在诱导COX-2表达的同时伴随着Akt磷酸化水平下降，而抑制COX-2表达则能够促进Akt活化。iNOS是Akt的下游靶点[20]，在MI/ IR过程中，活化的Akt能够通过调节iNOS水平，诱导NO合成[19,21]。在本研究中，当H9C2细胞中COX-2表达受到抑制时，细胞内Akt磷酸化水平提高，并伴随着iNOS表达水平和细胞内NO浓度上升，然而，这一过程能够被Akt特异性抑制剂LY294002 或者iNOS 特异性抑制剂1400W 阻断，从而失去对心肌细胞的保护作用。综上，这些观察表明，抑制COX-2可能通过Akt/iNOS/NOS信号通路的活化来防御细胞凋亡。

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Inhibition of COX-2 protects against cardiomyocyte apoptosis via Akt/iNOS/NO pathway

SUNXiao-ting1,JIANGXi2,PANGLei1,etal.

(1.DepartmentofAnesthesiology,2.HealthManagementCenter,TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To explore the potential relationship and mechanism between cyclooxygenase-2 (COX-2) expression and apoptosis during myocardial ischemia /reperfusion injury(MI/ RI).Methods We simulated the process of MI/ RI by hypoxia /reoxygenation (H/R) experiment in both H9C2 cell line and primary rat cardiomyocytes,and detected the expression of COX-2 and apoptosis-related protein.Furthermore,COX-2 expression was inhibited by NS398,COX-2 specific inhibitor.Changes of cell apoptosis were detected,and the underlying mechanism was explored.Results Pre-treatment with NS398 significantly attenuated H/R-induced cell injury and apoptosis [increased expression of Bcl2 and reduced level of cleaved caspases-3 and TUNEL-positive cells] in cardiomyocytes.Conclusion In cardiomyocytes,H/R stimulation will activate COX-2 expression and induce cell damage through apoptotic pathway.Inhibition of COX-2 will protect cardiomyocytes against apoptosis via Akt/iNOS/NO signaling pathway.

COX-2；myocardial ischemia/ reperfusion injury (MI/ RI)；hypoxia/reoxygenation (H/R)；cardiomyocytes,apoptosis

吉林省教育厅135计划(2014-471)；吉林大学研究生创新基金资助项目(2016226)；吉林大学第一院第七届青年基金(JDYY72016023)

1007-4287(2017)02-0290-05

R541

A

2016-09-25)

*通讯作者