不同海拔高度交替低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响

李洁刘西锋

1西北师范大学体育学院（甘肃 兰州 730070）2西藏大学农牧学院

不同海拔高度交替低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响

李洁1刘西锋2

1西北师范大学体育学院（甘肃 兰州 730070）2西藏大学农牧学院

目的：探讨不同海拔高度交替低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响。方法：50只雄性Wistar大鼠随机分为5组：常氧对照组（C组）、常氧训练组（NT组）、2500 m低氧训练组（2500 m HT组）、3500 m低氧训练组（3500 m HT组）、2500 m～3500 m交替低氧训练组（2500 m～3500 m HT组），每组10只。除C组大鼠不进行运动训练外，其余各组大鼠分别在常氧，模拟海拔2500m、3500 m及2500 m～3500 m交替环境下进行递增负荷跑台训练和居住，每周训练6天，共4周。训练结束后处死大鼠，即刻取全血和骨骼肌样本，梯度离心法提取线粒体，测定血液红细胞数目（RBC）、血红蛋白（Hb）含量和骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体（CⅠ～Ⅳ）活性。结果：（1）RBC和Hb：与C组比较，各训练组都有显著提高（P＜0.01，P＜0.05）。与NT组比较，低氧训练组都有显著提高（P＜0.01）。与2500 m HT组和3500 m HT组比较，2500 m～3500 m HT组均显著提高（P＜0.01）。（2）CⅠ～Ⅳ活性：与C组相比，NT组CⅢ活性显著提高（P＜0.05），2500 m HT组CI活性显著提高（P＜0.05），3500 m HT组CⅠ和CⅢ活性显著提高（P＜0.01，P＜0.05），2500 m～3500 m HT组CⅠ～Ⅳ活性均显著提高（P＜0.01，P＜0.05）。与NT组相比，3500 m HT组CⅠ活性显著提高（P＜0.01），2500 m～3500 m HT组CⅠ、CⅡ活性显著提高（P＜0.01，P＜0.05）。与2500 m HT组相比，2500 m～3500 m HT组CⅡ活性显著提高（P＜0.05）。结论：低氧训练在提高骨骼肌线粒体呼吸链功能方面较常氧训练更具优势，且交替低氧训练效果最佳。

交替低氧训练；骨骼肌；线粒体；呼吸链；酶活性；血液

近些年来，随着竞技体育水平的不断提高，模拟低氧训练作为一种辅助训练手段已经被广泛运用。然而有学者提出让运动员长时间在同一海拔训练，运动员机体已经对该海拔缺氧刺激产生适应，使得运动员对该海拔高度缺氧刺激不敏感。为增强机体对缺氧的敏感性，产生了低氧交替训练的理论[1]，其主要包括高—高交替训练和高—平交替训练两种。骨骼肌是人体重要的运动和代谢器官，而线粒体是真核细胞氧化磷酸化的场所，在机体细胞正常能量代谢中有着重要意义。本研究应用人工低压低氧舱，模拟低氧训练，探讨不同海拔高度交替低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响，为寻求科学有效的低氧训练方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性健康2月龄Wistar大鼠60只，体质量130 g左右，由甘肃中医药大学实验中心提供，动物生产许可证：SCXK（甘）2011-0001，动物使用许可证：SYXK（甘）2011-0001。常规饲喂。经筛选将50只大鼠随机分为5组：常氧对照组（C组）、常氧训练组（NT组）、2500 m低氧训练组（2500m HT组）、3500 m低氧训练组（3500 m HT组）、2500 m～3500 m交替低氧训练组（2500 m～3500 m HT组），每组10只。常氧对照组在常氧环境中饲养，不进行运动训练；其他各组进行每天一次的水平跑台递增负荷训练，每周训练6天，休息1天，共训练4周，具体居住、训练环境及训练方案如表1所示。

表1 各组大鼠训练方案

1.2 低压低氧舱

用厚12 mm透明有机玻璃板制成一封闭舱（130× 70×55 cm3，可放入动物跑台），安装通入舱内的抽气阀和进气阀，然后与真空泵相连，开启真空泵，不断抽出舱内气体，造成舱内低气压。操纵气阀，调节抽气和进气的比例，使舱内形成模拟海拔2500 m及3500 m海拔的低压低氧环境[2]。舱内压力用标准海拔表校正。

1.3 取材及线粒体制备

训练方案结束后，所有大鼠在常氧环境恢复生活2天，按0.3 ml／100 g体重剂量，腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，腹主动脉取全血待测。然后于冰盘上迅速取出股四头肌，在冷生理盐水中除去脂肪等结缔组织后，置于液氮中冷冻，-20℃低温保存待用。

将低温保存样本取出，自然融化，在冰浴中将股四头肌剪成碎块，并按重量体积比1：5加入匀浆缓冲液（缓冲液组成：0.1 mol/L KCl、5 mmol/L Tris-Hcl、pH 7.4），电动匀浆器匀浆（匀浆30 s，间隔30 s，反复3次）。匀浆液2000 r/min离心15 min，取上清液，将沉淀按重量体积比1：5加入缓冲液悬浮，2000 r/min离心15 min，取上清，将两次上清混合，12000 r/min离心15 min，弃上清，所得沉淀加入适量缓冲液，充分混合后，12000 r/min离心15 min，所得沉淀物即为线粒体[3]。线粒体分离过程全部在0～4℃下进行。将制备的线粒体用悬浮液（30 mmol/L蔗糖、20 mmol/L Tris-Hcl、0.1%BSA、pH 7.2）悬浮待用。

1.4 指标测试方法

使用全血分析仪测定血液红细胞（RBC）数及血红蛋白（Hb）含量。

以牛血清白蛋白为标准，用考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白质含量。

参照Vyatkina的方法[4]进行线粒体酶复合体（CⅠ～Ⅳ）活性的测定。将10～20 μg的线粒体蛋白加入到终体积为2 mL的缓冲液中，以蒸馏水作空白管，校正吸光度值到0点，分别测定波长340、550、600 nm处3 min吸光度值的变化。酶活性单位为μmol·mg protein-1·min-1。

1.5 主要仪器

低压低氧舱（自制），海拔表（德国），DSPT-202型动物跑台（中国杭州钱江科工贸公司制造），YQ-3型电动匀浆机（江苏金坛市仪表仪器厂），UVmimi-1240岛津紫外可见光分光光度计（日本岛津精密科学仪器有限公司），Universal 32R低温高速离心机（德国）。

1.6 数据统计处理

所有实验数据以平均数±标准差表示，组间用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血液指标的比较

红细胞数目：与C组比较，NT组、2500 m HT组、3500 m HT和2500 m～3500 m HT组均显著提高（P＜0.05，P＜0.01）；与NT组比较，2500 m HT组、3500 m HT和2500 m～3500 m HT组均显著提高（P＜0.01）；与2500 m HT组比较，3500 m HT组无显著性提高，2500 m～3500 m HT组显著提高（P＜0.01）；与3500 m HT组比较，2500 m～3500 m HT组显著（P＜0.01）提高。见表2。

血红蛋白含量：与C组相比，NT组、2500 m HT组、3500 m HT和2500 m～3500 m HT组均显著提高（P＜0.05，P＜0.01）；与NT组相比，2500 m HT组、3500 m HT和2500 m～3500 m HT组均显著提高（P＜ 0.01）；与2500 m HT组相比，3500 m HT组无显著性提高，2500 m～3500 m HT组显著提高（P＜0.01）；与3500 m HT组相比，2500 m～3500 m HT组显著（P＜0.01）提高。见表2。

表2 各组大鼠RBC数、Hb含量比较（n=10）

2.2 各组提取线粒体蛋白质含量

提取的各组线粒体蛋白质含量分别为（μg/ml）：C组1459.31，NT组1279.03，2500 m HT组1186.37，3500 m HT组912.61，2500 m～3500 m HT组902.95。

2.3 各组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体（ CCⅠ～Ⅳ）活性比较

与C组比较，NT组CⅢ活性显著提高（P＜0.05），CⅠ、CⅡ和CⅣ活性均提高，但均无显著性变化；2500 m HT组CⅠ活性显著提高（P＜0.05），CⅡ、CⅢ和CⅣ活性均提高，但均无显著性差异；3500 m HT组CⅠ和CⅢ活性显著提高，（P＜0.01，P＜0.05），CⅡ和CⅣ活性均提高，但均无显著性差异；2500 m～3500 m HT组CⅠ～CⅣ活性均显著提高（P＜0.01，P＜0.05）。

与NT组比较，2500 m HT组CⅠ、CⅡ、CⅣ活性均有提高，但均无显著性差异，CⅢ活性降低，也无显著性差异；3500 m HT组CⅠ活性显著提高（P＜0.01），CⅡ和CⅣ活性均提高，但均无显著性差异，CⅢ活性降低，也无显著性差异；2500 m～3500 m HT组CⅠ和CⅡ活性显著提高（P＜0.01，P＜0.05），CⅣ活性提高，CⅢ活性降低，但均无显著性差异。

与2500 m HT组比较，3500 m HT组CⅠ～Ⅳ活性均提高，但均无显著性差异；2500 m～3500 m HT组CⅡ显著提高（P＜0.05），CⅠ、CⅢ和CⅣ活性均提高，但均无显著性差异。

与3500 m HT组比较，2500 m～3500 m HT组CⅠ、CⅡ和CⅣ活性均提高，CⅢ活性降低，但无显著性差异。见表3。

表3 各组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活性比较（各组均n=10，μmol·mg protein-1·min-1）

3 讨论

3.1 不同海拔高度交替低氧训练对大鼠血液指标的影响

由本实验结果可以看出，常氧训练组RBC相比安静对照组有一定的升高，低氧训练组的红细胞数目显著高于常氧训练组，在低氧训练组中2500 m～3500 m交替低氧训练组的红细胞数目显著高于2500 m低氧训练组和3500 m低氧训练组。Hb含量的变化趋势与红细胞数量变化趋势相一致，其由高到低的顺序均为：2500 m～3500 m HT组＞3500 m HT组＞2500 m HT组＞NT组＞C组。说明运动训练可以提高机体RBC和Hb含量，低氧刺激加运动训练更有利于提高机体的RBC数量和Hb含量，且不同海拔的交替低氧训练比固定海拔的低氧训练能进一步提高RBC数量和Hb含量。已有的研究结果与本实验有一致之处，即与常氧训练对照组相比，高住高练组（模拟海拔3500 m高度）大鼠血液RBC、Hb显著升高[5]。本实验结果还得到张缨等研究的支持[6]，其研究发现氧浓度为14.2%（相当于海拔3000 m所对应的氧浓度）的高住高练低训与15.4%（相当于海拔2500 m所对应的氧浓度）相比，能更快更有效地提高RBC和Hb的生成。

本实验结果说明：常氧运动训练可提高机体RBC和Hb的生成，低氧训练能进一步促进RBC和Hb的生成，且在一定海拔范围内，高海拔比低海拔训练更有效。另外，不同海拔交替低氧训练比固定海拔低氧训练效果更好。

影响氧在体内运输的两个主要因素是血氧容量和Hb对氧的亲和力，RBC的运氧功能主要通过Hb来实现，Hb浓度决定了血液携带氧的能力，也影响周围组织的氧利用。因此，RBC和Hb增加将使血氧容量增加，从而提高机体的运氧能力。本研究结果显示，交替低氧训练组大鼠RBC数量和Hb含量显著高于3500 m低氧训练组、2500 m低氧训练组及常氧训练组，表明交替低氧训练组大鼠血氧容量升高最为显著，有利于提高大鼠血液的运氧能力，也促进周围组织的氧利用。因此，交替低氧训练是提高机体运氧能力较好的训练模式。

3.2 不同海拔高度交替低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶活性的影响

本研究发现，4周递增负荷训练后，常氧训练组、2500 m低氧训练组、3500 m低氧训练组及2500 m～3500 m交替低氧训练组大鼠股四头肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅣ活性均高于常氧对照组，表明不论是常氧环境还是低氧环境，运动训练均可提高大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能。与常氧训练组相比，除CⅢ活性无显著性降低外，2500 m低氧训练组、3500 m低氧训练组及2500 m～3500 m交替低氧训练组呼吸链CⅠ、CⅡ、CⅣ均有提高，其中CⅠ活性在3500m低氧训练组和2500 m～3500 m交替低氧训练组显著提高，CⅡ活性在2500 m～3500 m交替低氧训练组显著提高。CⅣ活性在2500 m低氧训练组、3500 m低氧训练组及2500 m～3500 m交替低氧训练组均无显著性提高。这表明在改善线粒体呼吸链功能方面，低氧训练较常氧训练更有效。已有研究表明，模拟海拔2500 m高度低氧训练4周，低氧训练组大鼠股四头肌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性显著高于常氧安静组、常氧运动组和低氧安静组，低氧运动组苹果酸脱氢酶（MDH）的活性也比常氧安静组、常氧运动组和低氧安静组高，但只与常氧安静组和低氧安静组有显著性差异[7]。模拟3500 m海拔高度低氧训练6周，高住高练组大鼠腓肠肌柠檬酸合成酶（CS）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）活性显著高于常氧训练组[8]。据此推断，低氧训练在改善线粒体呼吸链功能方面较常氧训练更有效，其机制可能与低氧训练更有效地提高三羧酸循环酶的活性，使进入呼吸链的底物NADH及FADH2更加充足，通过底物调节机制促进呼吸链酶的活性，从而使呼吸链功能得到提高。本研究结果还得到本研究小组先前研究结果的支持，即模拟海拔3500 m低氧环境，高住高练组骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～Ⅱ活性显著高于常氧训练组[9]。

本研究还发现，在提高呼吸链酶活性方面，与安静对照组相比，常氧训练组CⅢ活性著性提高，2500 m低氧训练组CⅠ活性显著提高，3500 m低氧训练组CⅠ和CⅢ活性均显著提高，2500 m～3500 m交替低氧训练组CⅠ～CⅣ活性均显著提高。由此可看出，在常氧环境下进行训练，骨骼肌线粒体呼吸链CⅢ最敏感，在2500 m低氧环境下进行训练，呼吸链起始酶CⅠ最敏感，在3500 m低氧环境下进行训练，呼吸链起始酶CⅠ和CⅢ最敏感，2500 m～3500 m交替环境下进行训练，CⅠ～CⅣ都比较敏感。这说明不同氧浓度复合运动训练对线粒体呼吸链不同部位酶活性的影响不同，其机制还有待进一步研究。

另外，由本研究结果还可看出，线粒体呼吸链CⅠ活性由高到低为：2500 m～3500 m HT组＞3500 m HT组＞2500 m HT组＞NT组＞C组，且常氧训练组高于安静对照组，低氧训练组显著高于安静对照组，交替低氧训练组最高。CⅡ活性由高到低为：2500 m～3500 m HT组＞3500 m HT组＞2500 m HT组＞NT组＞C组，其活性也呈现常氧训练组和低氧训练组均高于安静对照组，且交替低氧训练组显著高于安静对照组，交替低氧训练组最高。CⅢ活性由高到低为：NT组＞3500 m HT组＞2500 m～3500 m HT组＞2500m HT组＞C组，除2500 m HT组外，其余各组均显著高于安静对照组，且低氧训练组与常氧训练组之间无显著性差异。CⅣ活性由高到低为：2500 m～3500 m HT组＞3500 m HT组＞2500 m HT组＞NT组＞C组，常氧训练组和低氧训练组均高于安静对照组，且交替低氧训练组显著高于安静对照组，交替训练组最高。这说明，在提高骨骼肌线粒体呼吸链功能方面，交替低氧训练好于固定高度低氧训练和常氧训练。高-高交替训练比恒定海拔高度训练在改善呼吸链功能方面效果更佳，其机制可能与机体长时间在同一海拔训练可对该海拔缺氧刺激产生适应，使得该海拔高度对机体缺氧刺激不敏感，而交替海拔缺氧增强了机体对缺氧的敏感性，从而将机体潜力最大程度的挖掘出来有关。因此，高-高交替低氧训练在改善骨骼肌线粒体呼吸链功能方面是一种较好的训练模式。另外，机体运输氧的能力提高也有助于线粒体呼吸功能的提高。

4 结论

低氧训练在提高骨骼肌线粒体呼吸链功能方面较常氧训练更具优势，且交替低氧训练效果最佳。

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Effects of Alternating Hypoxia Training at Different Altitudes on Mitochondrial Respiratory Function of Skeletal Muscles in Rats

Li Jie1，Liu Xifeng2
1 College of Physical Education，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China 2 College of Agricultural and Animal Husbandry，Tibet University，Nyingchi 860000，China Corresponding Author：Lijie，Email：lijie2005ty@126.com

ObjectiveTo explore the effects of alternating hypoxia training at different altitudes on mitochondrial respiratory function of skeletal muscles in rats.MethodsFifty healthy male Wistar rats were randomly divided into a normoxic control group（C），a normoxic training group（NT），a 2500 m hypoxia training group（2500 m HT），a 3500 m hypoxia training group（3500 m HT）and a 2500 m-3500 m alternating hypoxia training group（2500 m-3500 m HT），each of 10.Except group C，all the other groups received the incremental load treadmill training 6 days a week and lived in the attitudes their group name indicated for 4 weeks.The rats of all groups were killed as soon as the training ended，and the whole blood and skeletal muscle samples were taken immediately.Their mitochondria were extracted using the gradient centrifugation.The number of red blood cell（RBC），hemoglobin content（Hb）and the activity of skeletal muscle mitochondrial respiratory chain complex（CⅠ～Ⅳ）were measured.Results（1）The average numbers of RBC and Hb content increased significantly（P＜0.05，P＜0.01）in train-ing groups compared with group C，those of group NT were significantly lower than hypoxia training groups（P＜0.01）.Compared with 2500 m HT and 3500 m HT groups，those of the 2500 m～3500 m HT group increased significantly（P＜0.01）.（2）Compared with group C，the CⅢactivity of group NT，CⅠactivity in 2500 m HT group，CⅠand CⅢactivity of 3500 m HT group and CⅠ～Ⅳactivity of 2500 m～3500 m HT group increased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.Compared with the NT group，the CⅠactivity of 3500 m HT group，CⅠand CⅡactivity of 2500 m～3500 m HT group were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.Compared with the 2500 m HT group，the CⅡactivity of 2500 m～3500 m HT group was significantly increased（P＜0.05）.ConclusionThe hypoxia training has more advantages than normoxic training in improving skeletal muscle mitochondrial respiratory chain function，and the effect of alternating hypoxia training is the best.

alternating hypoxia training，skeletal muscle，mitochondria，respiratory chain，enzyme activity，blood

2016.05.26

李洁，Email：lijie2005ty@126.com