腺病毒介导的Dectin-1基因小鼠呼吸道表达模型的构建和评价

钱 倩，刘志成，孙文逵，施 毅

（1东南大学附属南京市胸科医院，江苏南京210029；2广东省惠州市中心人民医院，广东惠州516001；3南京总医院呼吸内科，南京大学呼吸病研究所，江苏南京210002；4南京医科大学第一附属医院呼吸内科，江苏南京210029）

·基础与转化医学·

腺病毒介导的Dectin-1基因小鼠呼吸道表达模型的构建和评价

钱 倩1，刘志成2，3，孙文逵3，4，施 毅3

（1东南大学附属南京市胸科医院，江苏南京210029；2广东省惠州市中心人民医院，广东惠州516001；3南京总医院呼吸内科，南京大学呼吸病研究所，江苏南京210002；4南京医科大学第一附属医院呼吸内科，江苏南京210029）

目的：研究采用气管内注射给予Dectin-1重组腺病毒的方法建立气道Dectin-1上调表达小鼠模型，并进行模型验证和安全性评价.方法：BALB／c小鼠分为PBS组、Ad-EGFP（recombinant adenovirus encoding EGFR）组、Ad-mDectin-1（recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1）组，经气管给予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1.通过real-time PCR、免疫组化等方法动态评估肺组织Dectin-1表达变化.通过ELISA检测肺组织匀浆及血液中IL-6水平，激光共聚焦检测腺病毒载体在肺组织及肝脏的分布.结果：气管内给药后，在第3天可以观察到Ad-mDectin-1组小鼠肺组织Dectin-1 mRNA水平约为PBS组、Ad-EGFP组的18倍.Ad-mDectin-1组与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）.给药后第3、5、7、14天，Ad-mDectin-1组免疫组化见Dectin-1主要定位于细支气管.随时间推移，Dectin-1水平逐渐增高，第5天达高峰，第14天气道上皮细胞仍有Dectin-1表达.给药后第3天，激光共聚焦显微镜观察Ad-mDectin-1显示在肺组织中Ad-mDectin-1组及Ad-EGFP组可见绿色荧光，而PBS组未见绿色荧光.在肝脏组织中，各组均无绿色荧光蛋白表达.肺组织及血清中IL-6水平检测示各组差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：通过气管内给予Ad-mDectin-1成功上调小鼠肺组织Dectin-1水平，Dectin-1主要表达于细支气管上皮细胞，表达高峰在第5天，可持续2周以上.另外，经气管给予Ad-mDectin-1对小鼠生存和活动无明显影响，无明显炎症反应及远隔器官肝脏的播散.

Dectin-1；腺病毒载体；基因治疗；侵袭性肺曲霉病；天然免疫

0 引言

近年来，随着免疫抑制人群的增加，侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的发病率呈上升趋势［1］.即使通过不断改进的检测手段早期诊断，采取预防性治疗和经验性治疗等措施，其死亡率仍高达50%～90%［1］.宿主天然免疫在抗真菌感染中的作用和机制受到了广泛重视［2］.模式识别作用是抗真菌天然免疫的始动环节，而模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）是天然免疫应答的始动点.通过调节PRRs的表达，干预宿主天然免疫状态，成为曲霉防治的突破点.树突状细胞相关C型凝集素-1（dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1）是重要的PRRs，通过识别真菌细胞壁的β-1，3葡聚糖，在抗真菌免疫过程中发挥重要作用，参与介导免疫细胞对曲霉的识别和吞噬［3］.既往研究表明，巨噬细胞培养基中添加Dectin-1胞外区蛋白能显著增强其杀灭曲霉的能力［4］.小鼠体内试验也提示，经尾静脉注射表达Dectin-1胞外区蛋白的重组腺病毒能提高小鼠烟曲霉感染生存率［4-5］.随着关于基因治疗的动物及临床试验深入研究，基因治疗在疾病治疗方面的应用得到广泛关注［6］.目前基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载体，腺病毒载体可以转染非分裂期细胞，遗传毒性低，对肺组织具有亲嗜性，因此广泛应用于呼吸系统疾病基因治疗的研究［7］.课题组前期研究，构建了包含小鼠6号染色体上CLEC7A基因的6个外显子中的编码区（coding sequence，CDS）735 bp碱基的重组腺病毒载体（adenovirus，ad），并进行鉴定及纯化［8］.并在体外实验，通过Dectin-1高表达的小鼠肺泡巨噬细胞模型，验证了该腺病毒载体在烟曲霉感染中的保护性作用［9］.研究拟进一步在小鼠体内实验通过气道内滴入给药的方式，探索短期提高和强化宿主的气道上皮细胞和专职免疫细胞天然免疫功能的方法，初步探究有效的基因治疗途径，为未来的应用研究奠定理论基础.

1 材料和方法

1.1 实验分组及给药方式腺病毒的制备及纯化同前.实验分组:BALB／c小鼠分为PBS组，腺病毒空载体对照组（Ad-EGFP），腺病毒实验组（Ad-mDectin-1）.PBS组给予30 μL PBS溶液；Ad-EGFP对照组给予30 μL Ad-EGFP；Ad-mDectin-1组给予30 μL AdmDectin-1，病毒液滴度为3×108PFU.实验中各组小鼠麻醉后，经颈部暴露气管，使用微量注射器经气管软骨环间隙穿刺并注入药物，注射后立即将小鼠直立旋转，尽量使药物均匀分布于两肺，并将小鼠直立固定30 min后在原饲养环境下继续饲养.

1.2 标本收集实验各组小鼠气道内注射给药后第3天，摘除眼球收集血液置于EP管中常温静置1 h，然后4℃1500 g×10 min离心，收集血清，分装保存于-80℃；右下肺4%多聚甲醛固定，进行HE染色及免疫组化；左肺置于无酶的冻存管中，-80℃保存，用于提取RNA；右肺上叶及肝脏OCT包埋，用于制作冰冻切片；右肺中叶置于EP管内-80℃保存，用于ELISA检测.

1.3 HE染色方法肺组织固定，组织蜡块包埋后切片，厚度为5 μm.将组织切片进行HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.

1.4 免疫组化石蜡切片经烤片、脱蜡脱水、抗原修复、冲洗、封闭.加入兔抗小鼠Dectin-1抗体（1∶200）37℃孵育1 h，二抗孵育后，进行DAB显色，终止反应.经脱水、透明、封片镜检.每张切片拍摄3张含支气管的图片，用Image ProPlus 6.0软件分析，计算每个的支气管壁积分光密度（integrity optical density，IOD），同时计算其面积，从而获得其平均光密度.每个将3个视野平均光密度值的平均值作为本张切片的最终值.

1.5 Real-Time PCR检测肺组织Dectin-1水平肺组织经液氮研磨、裂解、萃取等步骤提取总RNA，逆转录为cDNA，并进行RealTime PCR反应，操作按试剂盒说明书进行.

所用到的引物序列如下:Dectin-1上游引物5'-TTCAGCACTCAAGACATCCATAA-3'，下游引物5'-CAGCAACCACTACTACCACAAAG-3'；β-actin上游引物5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游引物5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'.反应条件如下，95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃30 s，40个循环.反应体系在Real-Time PCR仪上进行扩增.采用2-△△CT法计算出每个样本目的基因的相对表达量.

1.6 ELISA检测肺组织及血清中IL-6水平肺组织及血清中细胞因子IL-6的含量根据试剂盒的说明书逐步进行.

1.8 统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析，实验结果以±s表示，组间比较采用LSD-t检验法，各组方差不齐则采用Tamhane's T2检验.以P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 Ad-mDectin-1气管滴入后小鼠肺组织Dectin-1表达变化

2.1.1 肺组织Dectin-1 RNA表达变化 经气管内给予Ad-mDectin-1第3天.Real-Time PCR结果示Ad-mDectin-1组小鼠肺组织Dectin-1 mRNA水平（88.092±14.047）显著高于PBS对照组（4.798±1.720）及Ad-EGFP对照组（5.259±0.844），差异有统计学意义（P＜0.05，图1）.

图1 肺组织Dectin-1 mRNA Real-Time PCR检测结果

2.1.2 肺组织Dectin-1蛋白表达变化 经气管给药后第3、5、7、14天进行肺组织免疫组化染色.Ad-mDectin-1组可见Dectin-1主要定位于细支气管，棕黄色阳性颗粒位于胞浆及胞膜.而肺泡上皮未发现明显阳性颗粒沉着.PBS对照组及Ad-EGFP对照组均未见肺气道上皮细胞有棕黄色阳性颗粒沉着.另外，Ad-mDectin-1组Dectin-1水平逐渐增高，在第5天达高峰，第14天气道上皮细胞仍有Dectin-1表达（图2A）.Image Pro Plus 6.0软件分析Ad-mDectin-1组肺组织Dectin-1平均光密度发现，平均光密度值从第3天开始上升，并在第5天达高峰，第14天明显下降（图2B）.

图2 肺组织Dectin-1蛋白表达观察

2.2 经气管给予Ad-mDectin-1安全性评价

2.2.1 小鼠一般情况和肺组织组织学观察 实验组和对照组给药后出现不同程度的活动减少，对刺激反应下降.给药1天后恢复正常，各组均未出现体质量、进食、活动等异常，也未出现死亡.

给药后肺组织HE染色显示，第3天以气道旁多核粒细胞及单核细胞轻微浸润为主，第7天开始出现淋巴细胞浸润，并形成滤泡样集聚，未见明显肺上皮细胞坏死及肺组织结构改变（图3）.

图3 肺组织病理HE染色结果（×100）

2.2.2 Ad-mDectin-1肝脏分布情况评价 转染Ad-mDectin-1和Ad-EGFP后，细胞均表达绿色荧光蛋白，可通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达评价Ad-mDectin-1在肝脏的分布情况，间接评价腺病毒载体在全身的播散情况.结果显示，在肝脏组织中两组均未发现绿色荧光蛋白表达，说明该病毒载体经气管给药后，局限分布在肺组织内，尚未发现播散证据（图4）.

我们此次需要完成的是2048游戏的AI，即只通过算法进行方向移动，在不经过任何人为干预的情况下获取游戏胜利。算法优劣的评判标准有三个：一是游戏胜率评估，即超过2048的概率要尽可能大；二是最高分评估，即游戏中所获取的最大值要尽可能大；三是等待时间，即每步之间等待时间不能过长。

图4 肝脏组织荧光蛋白表达观察（×200）

2.2.3 肺组织及血清中IL-6表达评价 通过ELISA方法检测肺组织及血清中IL-6水平，评价腺病毒载体对于小鼠全身及肺组织局部炎症影响.检测气管给药后第3天肺组织及血清中IL-6水平，Ad-mDectin-1组IL-6（1607.362±255.924 pg／mL）与PBS组（1428.544±308.359 pg／mL）及Ad-EGFP组（1523.526±286.101pg／mL）比较，差异无统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.875；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.598）（图5）.

图5 ELISA检测肺组织及血清中IL-6表达水平

3 讨论

基因治疗是目前药物研发的热点之一，通过针对目标细胞导入外源基因，达到预防和治疗疾病的目的.由于免疫抑制剂及免疫调节剂的使用，侵袭性曲霉病的发病率逐年增加，在免疫缺陷及造血干细胞移植的患者中，病死率更是居高不下［10］.抗真菌药物的预防性治疗和经验性治疗效果不佳.先天和后天免疫异常导致宿主免疫系统不能有效识别和控制曲霉感染［11］.因此，从调控机体免疫功能入手，可能为IA治疗提供新策略.

基因载体的选择是重要环节，腺病毒是当前较常选用的载体系统［12-13］.腺病毒载体已发展至第三代辅助病毒依赖型腺病毒载（helper-dependent adenovirus），此类腺病毒载体只保留了最小数量的顺式作用元件，能够留出更多空间装载外源基因及其表达所需的调控序列，因其缺失了全部或大部分腺病毒基因，极大地降低了前两代腺病毒所具有的细胞毒性，延长了外源基因的表达时间［14］.以往研究证实腺病毒载体十分适合肺部基因治疗，已广泛应用于癌症及感染模型的实验研究中［15-17］.有报道通过支气管镜给予Ad-P53治疗支气管肺泡癌的临床研究，并取得较好效果［18］.本部分研究正是利用第三代辅助病毒依赖型腺病毒载体构建的重组腺病毒Ad-Dectin-1构建局部给药的小鼠模型.

Dectin-1作为一种机体免疫细胞识别真菌的主要模式识别受体，在机体对曲霉等真菌的吞噬及杀灭过程中发挥重要作用［19-20］.既往已有研究构建表达Dectin-1的载体，用于真菌感染的早期诊断和防治.有研究使用非稳定性二氢叶酸还原酶表达载体，构建表达Dectin-1胞外区可溶性蛋白的重组载体，用于检测真菌细胞壁的β-葡聚糖［21］.Mattila等［4］首次尝试利用腺病毒载体构建表达带有小鼠IgG1Fc段和Dectin-1胞外区的重组腺病毒，通过体内外实验证实Dectin-1表达增加在抗真菌感染过程中具有积极作用.既往研究通过尾静脉注射Ad-Dectin-1-Fc（recombinant adenovirus encoding Dectin-1-Fc）能够提高小鼠烟曲霉感染生存率，降低肺组织真菌负荷［4］.本研究通过局部使用Dectin-1重组腺病毒载体，上调气道上皮细胞Dectin-1表达，从而达到调控机体抗曲霉免疫的目标.

载体的投送途径是基因治疗的重要环节.在小鼠模型中，腺病毒载体投送至肺部主要有4种途径:①经鼻滴入:优点是创伤小，操作简单.但存在病毒丢失，投送效率较低，无法判断进入肺部病毒量等缺点.②经口气管途径:相对于滴鼻，可减少病毒丢失，肉眼行小鼠气管插管难度较大.③经气管途径:为本实验采用的方法，该法损伤较大，且模型一次耐受病毒量有限，但投送效率最高.④雾化吸入:需使用雾化器，雾化病毒颗粒大小、速率等其肺部沉积部位.该法损伤小，但病毒载体消耗大，亦无法准确计算肺部沉积病毒量［22-23］.既往研究表明经过气道途径给予腺病毒载体，目标产物主要集中在肺部表达，在远隔器官无明显表达，有效减少其全身副反应.Alema-ny等［24］发现腺病毒入血后会很快在肝脏被清除，病毒的半衰期小于2 min.这与我们的研究结果类似，通过激光共聚焦显微镜、病理染色、ELISA等方法，证实经气道给予Ad-mDectin-1并没有对小鼠造成严重的病理损伤，同时也没有发现腺病毒载体在肝脏等远隔器官的证据.目前尚缺乏不同给药方式直接比较的动物模型研究，未来可以专门进行给药方式的研究.本研究经气道给予腺病毒载体能够避免腺病毒在血液中播散.

本研究采用微量注射器在气管软骨间隙注射Ad-mDectin-1的方式成功上调肺组织Dectin-1水平.Dectin-1mRNA水平较对照组明显增加，免疫组化可以观察到Dectin-1表达在细支气管及终末细支气管等上皮细胞明显增加.Dectin-1水平在第5天达高峰，在第14天仍可检测到支气管上皮细胞表达.Shao等［25］构建了Ad-mIFN-γ，通过滴鼻的方式给予该载体后明显增强免疫缺陷小鼠抗曲霉能力，小鼠生存率较对照组升高3倍多.上述研究都是利用腺病毒载体介导基因转染提高免疫缺陷小鼠对于曲霉的免疫力，都取得较好结果.相比之下，本研究将研究靶点选择在免疫反应的初始环节，与曲霉相关的重要模式识别受体Dectin-1，通过上调肺组织Dectin-1水平以期能够增强小鼠抗曲霉免疫功能.

综上所述，本研究通过Dectin-1重组腺病毒载体，采用气管内注射给药方式，成功上调了小鼠肺组织支气管上皮细胞Dectin-1表达，给予重组腺病毒载体并未对小鼠肺组织造成明显的病理损伤，为进一步利用该模型评价其在曲霉感染中的预防和治疗功能提供研究基础.

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Study on identification and security of the murine model administrated with recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1

QIAN Qian1，LIU Zhi-Cheng2，3，SUN Wen-Kui3，4，SHI Yi3
1Nanjing Chest Hospital Affiliated to Southeast University，Nanjing 210029，China；2Central People's Hospital of Huizhou，Huizhou 516001，China；3Department of Respiratory Medicine of Nanjing General Hospital，Institute of Respiratory Disease of Nanjing University，Nanjing 210002，China；4Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

AIM:To constructe a murine model of upregulation of Dectin-1 in the airway by intratracheal administration of Ad-m Dectin-1 and study on identification and security of the murine model.METHODS:BALB／c mice were divided into PBS group，Ad-EGFP group and Ad-mDectin-1 group，intratracheal administrated with PBS，Ad-EGFP and Ad-mDectin-1 respectively.After administration，the levels of Dectin-1 mRNA in lung tissue were tested by real-time PCR and immunohistochemitry，the levels of IL-6 in lung homogenate and serum were detected by ELISA，distribution of adenovirus vector in lung and liver was detected by confocal.RESULTS:At day 3 after administration of Ad-mDectin-1，the Dectin-1 mRNA expression was obviously increase in mice treated with Ad-mDectin-1，and was resulted in nearly eighteen fold increase compared with mice treated by Ad-EGFP or PBS.For mice treated with Ad-mDectin-1，immunohistochemistry results showed strong immunostaining in the airways epithelium in bronchioles and nearly negative immunostaining in alveolar walls，the immunostaining of Dectin-1 can last for two weeks.The positive particles were mainly located in cytoplasm and membrane of epithelial cells.In contrast，mice treated with PBS or Ad-EGFP did not detected immunostaining in the lungs.Immunostaining results showed time-dependent change of average optical density with peak reach at day 5 after administration.We used confocal microscopy to detect the green fluorescent protein which can emit green fluorescence under excitation of 488nm laser.We found green fluorescence in lung but not in liver.Results of ELISA showed no significantly differences of levels of IL-6 were founded compared with mice treated with Ad-EGFP or PBS.Pathology of lung tissue of mice treated with Ad-mDectin-1 showed mild inflammation reaction，characterized by polymorphonuclear cells infiltration at 3 day post-infection and peribronchial lymphocytes hyperplasia after 3 days.Necrosis and structure changes were not found.CONCLUSION:After intratracheal administration of Ad-mDectin-1，the expression of Dectin-1 in the lungs of mice is successful upregulated.Location of Dectin-1 is mainly on airways epithelium in bronchioles.The peak of expression of Dectin-1 is at day 5 after administration of Ad-mDectin-1，expression of Dectin-1 can last for more than two weeks.After intratracheal of administration of Ad-mDectin-1，no significant adverse effect and obvious inflammatory reaction are observed.Adenovirus vector is mainly located in lung and does not spread to liver of distant organ.

Dectin-1；adenovirus vector；gene therapy；IPA；natural immunity

R511.8

A

2095-6894（2017）01-30-05

2016-11-16；接受日期：2016-12-02

国家自然科学基金资助项目（81270064，81500073），南京市医学科技发展一般项目（YKK13089）

钱 倩.博士，主治医师.研究方向:肺部感染、肺部肿瘤、胸膜疾病.Tel:025-83728558 E-mail:honeyhoney2007＠163.com

孙文逵.E-mail:sunwenkui2000＠126.com.施 毅.E-mail:shiyi56＠126.com