金雀异黄素协同雷公藤多苷干预去卵巢大鼠CIA的机制研究

李 丹，艾 浩，李晓明

（1锦州市妇婴医院产科，2锦州医科大学附属第一医院妇产科，3辽宁省卵泡发育与生殖健康重点实验室，4锦州医科大学组织胚胎学教研室，辽宁锦州121001）

金雀异黄素协同雷公藤多苷干预去卵巢大鼠CIA的机制研究

李 丹1，艾 浩2，3，李晓明3，4

（1锦州市妇婴医院产科，2锦州医科大学附属第一医院妇产科，3辽宁省卵泡发育与生殖健康重点实验室，4锦州医科大学组织胚胎学教研室，辽宁锦州121001）

目的：以去卵巢大鼠叠加Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）为实验材料，观察金雀异黄素协同雷公藤多苷的疗效及初步药理机制，为针对绝经后女性类风湿关节炎的治疗提供理论支持及实验证据.方法：采用通用的手术法摘除大鼠卵巢，采用牛Ⅱ型胶原二次免疫的方法制备类风湿关节炎动物模型（CIA），观察金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗雌激素低下型CIA的影响，同时与阳性药甲氨喋呤比较，评价该组合药物的药效.结果：与模型组比较，金雀异黄素协同雷公藤多苷组能较好地改善去卵巢CIA大鼠的关节肿胀及活动能力，大鼠关节炎指数及关节肿胀度均显著下降，关节组织病理程度得到明显改善.金雀异黄素协同雷公藤多苷组大鼠血清中TNF-α及IL-6水平显著降低（P＜0.05），而IL-10水平呈显著升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；金雀异黄素协同雷公藤多苷组大鼠外周血CD4+T细胞数量／比例显著减少（P＜0.01）.结论：雌激素低下状态可诱导CIA的发生并加剧CIA的病理程度.补充植物雌激素可显著提高现有抗RA的药效.

金雀异黄素；雷公藤多苷；去卵巢大鼠；类风湿关节炎

0 引言

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾病［1］，绝经期后女性RA发病率明显增高［2］，但临床缺乏有效控制绝经期后女性RA病情发展的治疗方案［3］.金雀异黄素通过免疫调节作用可显著改善胶原诱导的类风湿关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠的关节病理状态，有望成为改善自身免疫性疾病的补充用药［4］.本研究以去卵巢大鼠叠加Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎为实验材料，旨在探讨金雀异黄素协同雷公藤多苷的疗效及初步药理机制，为绝经后女性类风湿关节炎的治疗提供可借鉴思路.

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器金雀异黄素购自西安冠宇生物技术有限公司（含量≥98%），雷公藤多苷购自江苏美通制药有限公司（Z32021007），甲氨喋呤购自上海医药（集团）有限公司信宜制药总厂，牛Ⅱ型胶原、不完全弗氏佐剂、anti-collagenⅡ一抗均购自Chondrex公司（美国），大鼠TNF-α及大鼠IL-6、IL-10酶联免疫试剂盒购自Bender公司（美国）；大鼠皮质酮酶联免疫试剂盒（EIA-4164）购自德国DRG公司（批号: 61k059），PE-anti-Rat CD3（Clone G4.18）、FITC-anti-Rat CD4（Clone OX35）及FITC-anti-Rat CD8（Clone OX8）流式细胞术用荧光抗体为eBioscience公司产品.T10 BASIC手持式分散机（德国IKA），Leica-Qwin图像分析系统（德国Leica公司），K15离心机（德国Sigma），OLYMPUS AU640型全自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司），Beckman Gallios型流式细胞仪（美国Beckman公司）.

1.2 实验动物健康雌性SD大鼠，体质量（150± 10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物饲养证号:SCKK-2005-0004.清洁级动物室适应性喂养1周后进行分组和处理.普通饲料正常饲喂、自由饮水.

1.3 实验方法

1.3.1 去卵巢叠加CIA大鼠模型制备及评价 参照文献方法［5］手术摘除双侧卵巢，切除手术第28天，制备大鼠CIA模型［6］:牛Ⅱ型胶原（2 g／L）与等容积不完全弗氏佐剂混合、乳化处理（终浓度1 g／L），以0.2 mL／只（200 μg）于大鼠尾根部皮下注射，初次免疫大鼠.7 d后以0.1 mL／只（100 μg）于大鼠尾根行加强免疫.每隔一天测量关节炎指数和足趾肿胀度，评估CIA形成情况.参照5级评分法计算关节炎指数［7］.关节肿胀度测量法［8］，采用足趾容积测量仪测量踝关节的容积，计算关节肿胀度.

1.3.2 实验动物分组及给药方法 实验动物随机分为四组，即假手术组（n=10）、去卵巢CIA组（简称模型组，n=10）、甲氨喋呤治疗组（阳性药物对照，n=10）及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组（n=10）.治疗组动物于加强免疫之日起开始灌胃，给予甲氨喋呤（2.7 mg／kg体质量）、雷公藤多苷（70 mg／kg体质量）和金雀异黄素（30 mg／kg体质量）进行干预（1次／d），连续干预3周.假手术组及模型组大鼠灌胃给予等量的蒸馏水.

1.3.3 大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10水平检测依照ELISA试剂盒说明书的步骤操作，对大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10的水平进行测定，在酶标仪上用450 nm波长测OD值、计算anti-collagenⅡ、TNF-α、IL-6及IL-10水平.

1.3.4 大鼠外周血CD4+及CD8+细胞亚型分析 大鼠外周血CD4+及CD8+亚型分析采用流式细胞术，样品制备方法如下.大鼠麻醉后经腹主动脉采血（抗凝处理），收集1×106／mL细胞至3个1.5 mL EP管中，每管1 mL；用PBS洗液洗3次，重悬细胞至100 μL PBS洗液中；管中分别加入FITC-CD3和PE-CD4，FITC-CD3和PEcy5-CD8，以及同型对照抗体，4℃避光孵育30 min；用PBS洗液洗3次，弃上清，细胞用500 uL含1%多聚甲醛的PBS重悬，置4℃避光保存待测.

1.3.5 关节组织病理学检测 大鼠踝关节经10%福尔马林固定7 d后，采用福尔马林／硝酸脱钙液（Clayden氏液）脱钙、常规石蜡包埋，HE染色.依据通用病理评分标准对关节病理损伤做半定量分析.

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计学软件对数据进行处理，数据采用单因素方差分析（one-Way ANOVA）和LSD检验作组间比较，计量资料用s表示，组间比较用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 行为学观察结果行为学观察结果提示，去卵巢大鼠可被诱发较严重的关节炎病理改变.甲氨喋呤治疗组和金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠关节红肿状态明显减轻，活动相对增多.与甲氨喋呤治疗组比较，金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠体毛光泽度好，肛周污秽物显著减少，表明补充植物雌激素能较好地改善雌激素低下型CIA的病理过程.

2.2 各组大鼠关节肿胀度和关节炎评分结果比较与假手术组比较，模型组大鼠关节肿胀度及关节炎评分均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）.与模型组比较，甲氨喋呤及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠关节肿胀度及关节炎评分均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）.

表1 各组大鼠关节肿胀度和关节炎评分结果比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠关节肿胀度和关节炎评分结果比较（n=10，±s）

bP＜0.01 vs假手术组；aP＜0.05 vs模型组；dP＜0.01 vs模型组.

组别关节肿胀度（%）关节炎评分假手术组15.20±5.800.10±0.05模型组60.50±17.40b2.38±0.48b甲氨喋呤治疗组49.60±23.20d2.00±0.33a金雀异黄素协同雷公藤多苷组47.80±20.80d1.95±0.37d

2.3 关节组织病理学检测结果正常大鼠踝关节腔、关节软骨及滑膜组织结构完整、清晰.去卵巢CIA大鼠膝、踝关节可见明显的滑膜细胞增生，排列紊乱，滑膜组织充血水肿，毛细血管增生，并可见炎细胞浸润，增生的滑膜组织形成绒毛状，可伸向关节腔深处，或向软骨面爬行形成血管翳.

2.4 各组大鼠血清中TNF-α水平检测结果与假手术组比较，模型组大鼠血清中TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，甲氨喋呤和金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠血清中TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，表2）.

表2 各组大鼠血清中TNF-α水平检测结果比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠血清中TNF-α水平检测结果比较（n=10，±s）

bP＜0.01 vs假手术组；aP＜0.05 vs模型组；dP＜0.01 vs模型组.

组别T N F -α（n g／m L）假手术组1 9.5 0 ± 2.8 4模型组4 7.9 0 ± 9.8 1b甲氨喋呤治疗组4 1.1 0 ± 9.3 2a金雀异黄素协同雷公藤多苷组3 6.7 0 ± 7.7 6d

2.5 各组大鼠血清中IL-6和IL-10水平检测结果比较与假手术组比较，模型组大鼠模型血清中IL-6和IL-10的水平均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，甲氨喋呤治疗组IL-6和IL-10水平显著下降，金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠血清中IL-6水平显著下降，而IL-10水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05，表3）.

表3 各组大鼠血清IL-6及IL-10水平检测结果比较（n=10，±s）

表3 各组大鼠血清IL-6及IL-10水平检测结果比较（n=10，±s）

bP＜0.05 vs假手术组；aP＜0.05 vs模型组；dP＜0.01 vs模型组.

组别IL-6IL-10假手术组40.21±5.7421.04±3.27模型组68.37±5.99b54.38±10.15b甲氨喋呤治疗组52.16±7.99a46.76±5.39a金雀异黄素协同雷公藤多苷组47.77±6.18a71.36±7.99d

2.6 各组大鼠外周血CD4+、CD8+亚型检测结果比较与假手术组比较，模型组大鼠血清中CD4+T细胞数量显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05），而CD8+T细胞数量没有明显改变.与模型组比较，甲氨喋呤及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠外周血CD4+和CD8+T细胞数量均显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表4、图1）.

表4 各组大鼠外周血中T细胞亚群检测结果比较（n=10，±s）

表4 各组大鼠外周血中T细胞亚群检测结果比较（n=10，±s）

aP＜0.05 vs假手术组；cP＜0.05 vs模型组.

组别CD4+CD8+假手术组21.91±3.243.05±1.27模型组36.10±5.12a4.76±2.15甲氨喋呤治疗组26.10±3.73c1.65±0.39c金雀异黄素协同雷公藤多苷组24.10±2.57c1.06±0.99c

图2 大鼠外周血CD4+、CD8+细胞亚型检测结果

3 讨论

RA发病多见于女性［9］，女性在绝经前发病率平稳，口服避孕药或给予雌激素替代治疗对RA病情的稳定有明显促进作用［10］.绝经后发病率明显升高，提示雌激素与RA发病之间可能存在关联［11-13］.本研究发现，去卵巢大鼠由于缺少雌激素的生理调节作用，对Ⅱ型胶原诱发的CIA非常敏感.补充植物雌激素（金雀异黄素）能显著提高临床常规抗类风湿药物的疗效.雷公藤多苷与甲氨喋呤的药理机制类似［14］，主要通过免疫调节、抗炎等发挥抗RA的作用.然而，因其副反应及成分复杂、药理作用未彻底明了等因素，临床上并未得到广泛应用.本研究将有植物雌激素作用的天然异黄酮化合物金雀异黄素与雷公藤多苷配伍使用，以期为临床雌激素低下型RA的治疗提供新的组合药物.结果显示，去卵巢CIA大鼠血清中TNF-α水平显著升高，而金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠血清中TNF-α水平显著降低，提示雌激素低下状态可激活TNF-α相关信号通路，诱导其高表达.补充植物雌激素可通过调节TNF-α表达及相关分子事件提高现有抗RA药物的疗效.模型大鼠血清中IL-6和IL-10水平均显著增高，提示机体内存在炎性反应，IL-10水平升高则可能与机体的骨髓吸收的自我保护机能有关［15］.本研究观察到金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠血清中IL-6水平显著下降，而IL-10水平显著增高，提示其可能的药理机制包含通过调节IL-6／IL-10的平衡而减轻关节炎症反应，从而改善关节症状.

综上所述，金雀异黄素协同雷公藤多苷对去卵巢CIA具有较为肯定的疗效，在改善部分指标上优于甲氨喋呤，表明补充植物雌激素可显著提高现有抗RA的药效.其药理机制可能为:下调促炎性因子（TNF-α、IL-6）并上调抑制炎症细胞因子（IL-10）的水平，从而发挥抗炎作用.此外，通过抑制CD4+T细胞的分化，发挥免疫调节作用.

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Research on mechanisms of genistein combined with triptergium glycosides intervention on collagen induced arthritis（CIA）of ovariectomized rats

LI Dan1，AI Hao2，3，LI Xiao-Ming3，4
1Department of Obstetrics，Women and Infants's Hospital of Jinzhou，2The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，3Liaoning Key Laboratory of Follicular Development and Reproductive Health，4Department of Histology and Embryology，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China

AIM:Rheumatoid arthritis to superposition of ovariectomized rats with collagen induced II（collagen induced arthritis，CIA）were selected as experimental materials，and the synergistic effectandpreliminarypharmacologicalmechanismof tripterygium glycosides and genistein were observed，to provide theoretical support and experimental evidence for treatment of postmenopausal women with rheumatoid arthritis.METHODS:The rats were ovariectomized using general surgery method.The animal model of rheumatoid arthritis（CIA）was prepared using the method of secondary immune response of bovine type II collagen.The effect of genistein combined with tripterygium glycosides for the treatment of estrogen deficiency type CIA was observed，at the same time，the effect was compared with positive drug methotrexate，the curative effect of the combination of drugs was also evaluated.RESULTS:Compared with the model group，genistein combined with tripterygium glycosides group could better improve joint swelling and activity of ovariectomized CIA rats，and rat arthritis index and swelling degree were significantly decreased，the pathological degree of joint tissue was also obviously improved.The TNF-alpha and IL-6 level in the serum of rats of genistein combined with tripterygium glycosides group were significantly decreased，with statistically significant differences（P＜0.05），and the level of IL-10 was significantly increased，with a statistically significant difference（P＜0.05）；The number or the ratio of peripheral blood CD4+T cell in genistein combined with tripterygium glycosides group rats was significantly reduced，with a statistically significant difference（P＜0.01）.CONCLUSION:Estrogen deficiency can induce the occurrence of CIA and aggravate the pathological degree of CIA.Supplement of plant estrogen can significantly improve the effectiveness of the existing anti-RA.

Genistein；tripterygium glycosides；ovariectomized rats；rheumatoid arthritis

R285.5

A

2095-6894（2017）01-35-04

2016-10-16；接受日期：2016-11-02

辽宁省高等学校优秀人才支持项目（LJQ2013092）

李 丹.硕士，主治医师.研究方向:妇科生殖内分泌.E-mail:76936074＠qq.com

李晓明.E-mail:lixiaoming68327＠163.com