长托宁对大鼠脊神经结扎所致神经病理性疼痛模型的影响

陈功+冯涛

【摘要】 目的：探讨长托宁对大鼠脊神经结扎所致神经病理性疼痛模型的影响。方法：清洁级SD雄性大鼠60只，6～8周龄，质量150～180 g，采用随机数字表法，将其分为三组，假手术组（S组）、对照组（C组）和长托宁组（P组），每组各20只。假手术组分离暴露腰五神经但不结扎；对照组结扎腰五神经；长托宁组术前肌注长托宁0.07 mg/kg，结扎腰五神经，术后肌注长托宁0.07 mg/（kg·d），连续6 d。术后第7﹑32天进行机械性痛阈和热痛阈检测，取结扎处神经组织ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平。结果：术后第7天，C、P组术后机械性痛阈和热痛阈均明显低于S组（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明显高于S组（P<0.05）；P组术后机械性痛阈和热痛阈均明显高于C组（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明显低于C组（P<0.05）。术后第32天，C、P组各项指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：长托宁在神经损伤早期给予，能延缓神经损伤引起的病理性疼痛的发生发展过程，其机制可能与长托宁能改善受损组织局部的微循环，减轻炎症反应的作用有关。

【关键词】 长托宁； 神经病理性疼痛； 机械性痛阈； 热痛阈

【Abstract】 Objective： To investigate the effects of Penehyclidine hydrochloride on rats neuropathic pain induced by spinal nerve ligation model.Method：Clean levels 30 male SD rats，6～8 weeks of age，150 to 180 g， were randomly divided into 3 groups，sham operation group （S group），control group （C group） and penehyclidine hydrochloride group （P group），20 rats in each group.The S group was exposed but not ligated five lumbar nerve；the C group was ligated five lumbar nerve；P group preoperative intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/kg，ligated five lumbar nerve ligation，after intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/（kg·d） for 6 days.The mechanical pain threshold and heat pain threshold were detected seventh days after operation，the ligation of nerve tissue TNF-α and IL-6 levels were detected by ELISA method.Result：Seventh days after operation，C group and P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold was significantly lower than that of group S（P<0.05），TNF-α and IL-6 levels were significantly higher than that in S group（P<0.05）；P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold were significantly higher than that in C group（P<0.05），TNF-α and IL-6 were significantly lower than C group.After thirty-second days，there was no significant difference between the C group and P group（P>0.05）.Conclusion：Penehyclidine hydrochloride in nerve injury early，can delay the occurrence and development process of neuropathic pain caused by nerve injury.The mechanism may be related to penehyclidine hydrochloride can improve microcirculation damaged tissues， reduce the inflammatory reaction.

【Key words】 Penehyclidine hydrochloride； Neuropathic pain； Mechanical threshold； TWL

First-authors address：Baoan Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.34.007

神经病理性疼痛是指外周或中枢神经系统损伤后引起的疼痛综合征，它的特点是机械性异常性疼痛和热痛觉过敏[1]。盐酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride，PHC）注射液，商品名为长托寧，为我国首创的新型抗胆碱药，主要选择性的阻断M1、M3亚型胆碱受体，临床应用中发现该药在改善微循环中的作用较好[2]。本研究拟通过建立脊神经结扎的大鼠模型，观察长托宁对神经病理性疼痛的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁Ⅱ级雄性SD大鼠，6～8周龄，质量150～180 g，由广东医科大学动物实验中心提供。实验室温度为22～24 ℃，湿度40%～60%，周期光照8：00～20：00，所有处理遵照国际疼痛学会的伦理指导进行[3]。

1.2 主要试剂和仪器 长托宁由成都力思特制药有限公司提供，批号030722；机械性痛阈刺激仪和热辐射刺激仪购自中国医学科学院生物医学研究所；TNF-α和IL-6 ELISA法检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 按照文献[4]方法，大鼠腹腔注射3%水合氯醛2 mL深麻醉后，以两侧骼骨最高点连线与背部中线相交处偏左侧切开皮肤，切口长约2 cm ，分离皮下组织及肌肉，找到腰六的横突并移除，暴露腰四及腰五神经，小心分离腰五神经，用丝线扎紧，观察无明显活动出血后逐层缝合肌肉皮肤。术毕腹腔注射氨节青霉素防止术后感染，将大鼠置于饲养笼中，注意保温，水和食物供应充足。

1.3.2 实验分组 采用随机数字表法将60只大鼠分为3组，假手术组（S组）、对照组（C组）和长托宁组（P组），每组各20只。假手术组分离暴露腰五神经但不结扎；对照组结扎腰五神经；长托宁组术前肌注长托宁0.07 mg/kg，结扎腰五神经，术后肌注长托宁0.07 mg/（kg·d），连续6 d。

1.4 观察指标

1.4.1 机械性痛阈测定 将每组大鼠随机分为两组，每组10只，一组用于术后第7天观察，另一组用于第32天观察。采用Dixon[5]方法，将大鼠置入有机玻璃笼内，笼子的底部为小格子金属网，在测试开始前，先让大鼠在笼子内适应10 min。选取一组vonfrey纤毛（编号为3.65，3.87，4.10，4.31，4.52，4.74，4.92和5.16；分别对应0.45，0.74，1.26，2.04，3.31，5.50，8.32，和14.45 g）。从4.31号纖毛开始，用纤毛以垂直大鼠脚掌的方向刺激脚掌皮肤，力度以使纤毛微微弯曲为宜，刺激位置在大鼠第四第五脚趾之间的皮肤。大鼠在刺激当时或刺激结束时出现抬足认为阳性。如果出现阴性反应，继续选用下一个克数大的纤毛。如果出现阳性反应，继续选用下一个克数小的纤毛，以出现不同的反应为始，连续测6次，并记录结果。如果大鼠出现连续的阳性或阴性反应，直至0.45 g和14.45 g纤毛，那么按vonfrey编号，分别认定后一个编号5.28（18.72 g）或前一个编号3.54（0.34 g）为结果。

1.4.2 热痛阈的测定 观察大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜伏时间作为热痛阂。将每组大鼠随机分为两组，分别于术后第7﹑32天将大鼠放置于透明的有机玻璃笼中，笼子无底壁，将笼子放在一块3 mm厚的玻璃板上，这样动物的足底直接接触玻璃板，而测定探头紧挨着玻璃板的下面测定，减少系统误差。照射源为8伏，50瓦的灯泡，内有凹透镜聚焦，外罩金属外壳，上端有一直径5 mm的孔，这样灯泡离前端为40 mm。探头连接精确计时器，计时期与照射源电源同步，记录开始照射到出现缩爪反应的时间区间。以大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜伏时间作为热痛阈，测定值精确到0.1 s，所有动物照射内侧第一足趾的着力点，每个时点测定3次，间隔15 min/次，取平均值为热痛阈。单次照射时间不超过20 s，以免损伤照射部位[6]，所有测定由一个不知情的实验人员在相同时间点和相同实验条件下完成。

1.4.3 TNF-α和IL-6的检测 进行热痛阈和机械性痛阈测定后，处死大鼠，取出结扎处腰五神经，用4 ℃生理盐水制成1%匀浆，按ELISA法操作说明，检测TNF-α和IL-6的水平。

1.5 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

术后第7天，与S组比较，C、P组机械性痛阈和热痛阈均明显降低（P<0.01），TNF-α和IL-6水平均明显升高（P<0.01）；与C组比较，P组机械性痛阈和热痛阈均明显升高（P<0.05），TNF-α和IL-6水平均明显降低（P<0.05）。术后第32天，C、P组机械性痛阈和热痛阈均较S组明显降低（P<0.01），而C、P组机械性痛阈、热痛阈、TNF-α和IL-6水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。

3 讨论

神经病理性疼痛的发病机制并没有完全清楚，目前还没有好的治疗方法。研究发现，炎症反应在神经病理性疼痛的发生发展过程中起着重要作用[7]。在外周神经结扎后，华勒氏变性导致TNF-α生成，TNF-α是一种强有力的炎症介质，可激发中性粒细胞表达大量粘附分子，促进单核巨噬细胞分化，使其发生氧化爆发、脱颗粒、增强其吞噬功能，还可进一步诱导自身和其他细胞因子（如IL-1、lL-6、IL-8等）的产生和释放，导致神经损伤的加重[8-10]。外周神经损伤后产生的机械疼阈异常和热痛觉过敏与受损部位或背根神经节神经元自发和持续性地异常放电密切相关。外周神经损伤引起的炎性物质引起这种异常放电增加，进一步加重疼痛的产生[11-12]。

局部组织损伤后的炎症反应和疼痛引起的血小板聚集和炎症细胞浸润将导致血液粘稠度增加，导致微循环障碍。而微循环障碍进一步加重局部组织的缺血缺氧，从而加重损伤[13]。长托宁属于抗胆碱药物，与其他M胆碱受体阻断药物有相似的改善微循环障碍的作用，能够缓解血瘀症状[14-15]。

本研究显示，脊神经结扎后第7天，连续给予长托宁的P组相对于未给予长托宁的C组，其神经中TNF-α和IL-6水平明显降低，机械性痛阈异常和热痛阈过敏的现象得到明显改善，说明长托宁能减轻炎症反应，减轻神经损伤。在术后第32天，再次对各组大鼠进行观察时，笔者发现P组和C组炎症因子TNF-α和IL-6水平已大幅降低，两组之间各项指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。其原因，笔者分析可能有两点：第一：长托宁只在术后6 d连续给予，以后其作用慢慢消失；第二：长托宁虽然能改善受损组织局部的微循环，减轻炎症反应，延缓神经病理性疼痛的发生发展过程，但并不能改善神经的损伤程度。具体原因，有待进一步实验验证。

综上所述，笔者认为长托宁在神经损伤早期给予，虽不能减轻神经损伤引起的病理性疼痛，但能在一定程度上延缓神经病理性疼痛的发生发展过程。其机制可能与长托宁能改善受损组织局部的微循环，减轻炎症反应的作用有关。

参考文献

[1]丘玥，陈唯韫，王之遥，等.辛伐他汀对大鼠神经病理性疼痛行为学和RhoA通路表达的影响[J].中国疼痛医学杂志，2016，22（7）：493-500.

[2]郭立峰.雾化吸入长托宁对COPD患者肺功能和微循环的影响[J].山东医药，2012，52（26）：83-84.

[3] Zimmermann M.Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals[J].Pain，1983，16（2）：109-110.

[4] Kim S H，Chung J M.An experimental model for Peripheral Neuropathy Produced by segmental spinal nerve ligation in the rat[J].Pain，1992，50（3）：355-363.

[5] Dixon W J.Efficient analysis of experimental observations[J].Annu Rev Pharmacol Toxieol，1980，20（20）：441-462.

[6] Hargreaves K，Dubner R，Brown F.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain，1988，32（l）：77-88.

[7]鐘敏，曾因明，柳垂亮，等.脊髓TNF-α、IL-1β和IL-6在神经病理性疼痛过程中的表达变化[J].中国疼痛医学杂志，2010，16（1）：42-44.

[8]梅厚连，罗天友.强痛定联合对乙酰氨基酚对神经病理性疼痛大鼠模型促炎因子的影响[J].中国医药导报，2013，10（19）：34-36.

[9]杨建军，沈锦春，刘红军，等.加巴喷丁治疗大鼠腰5神经结扎后神经病理性疼痛的疗效及可能机制[J].医学研究生学报，2010，23（5）：465-469.

[10]南兴东，冯艺，张利萍.TNF-α在坐骨神经冷冻致神经病理性疼痛模型大鼠脊髓的表达[J].中国疼痛医学杂志，2012，18（1）：38-42.

[11]徐江涛，马柯.神经病理性疼痛中背根神经节交感神经芽生的机制研究[J].中国疼痛医学杂志，2015，21（7）：481-485.

[12] Roza C，Laird J M，Souslova V，et al.The tetrodotoxin resistant Na+ channel Navl.8 is essential for the expression of spontaneous activity in damaged sensory axons of mice[J].J Physiol，2003，550（3）：921-926.

[13]赵丽倩，毕胜利.细胞黏附分子在危重病微循环障碍中的作用[J].微循环学杂志，2014，24（1）：68-70.

[14]周开隆，何文真，李其斌，等.盐酸戊乙奎醚对大白兔耳微循环的影响[J].蛇志，2011，23（1）：9-10.

[15]董航，刘杨震，宇李霞，等.麻醉前应用新型抗胆碱药物对失血大鼠肠系膜微循环改变的影响[J].微循环学杂志，2015，25（2）：12-14.