应用碳青霉烯酶失活法检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌

牛 翠， 杨 靖， 时东彦

·论著·

应用碳青霉烯酶失活法检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌

牛 翠1， 杨 靖2， 时东彦2

目的 评估碳青霉烯酶失活法（carbapenem inactivation method，CIM）试验检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌产生碳青霉烯酶的能力。方法 收集121株鲍曼不动杆菌，应用全自动细菌鉴定仪进行菌株鉴定和药敏试验，CIM检测鲍曼不动杆菌所含碳青霉烯酶，应用PCR方法检测OXA-23型碳青霉烯酶基因。结果 121株鲍曼不动杆菌中68株对亚胺培南和美罗培南耐药，其中65株菌PCR显示携带OXA-23基因，66株菌CIM试验为阳性。52株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感，其中49株菌OXA-23阴性，52株菌CIM试验全为阴性。1株菌对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感，CIM试验阴性，OXA-23阳性。CIM试验的敏感性和特异性分别为94.2% 和 98.1%。结论 与PCR方法相比较CIM试验操作简便，成本小，结果易读，易于在实验室开展。应用CIM试验可以检测鲍曼不动杆菌OXA-23型碳青霉烯酶，

鲍曼不动杆菌； 碳青霉烯酶失活法； OXA-23型碳青霉烯酶

鲍曼不动杆菌因其导致医院感染和在重症患者间的传播越来越被关注[1]。在过去10年，对碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌的比例越来越高，成为治疗该菌感染的严重挑战[2]。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因是产碳青霉烯酶，其次为膜孔蛋白的缺失或下降导致膜通透性的减低，青霉素结合蛋白的改变等[3]。因此快速检测鲍曼不动杆菌是否含有碳青霉烯酶可以为临床及时治疗提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 选择河北医科大学第二医院2015年5－6月和邢台市第三医院2014年1月－2015年6月从临床标本分离鲍曼不动杆菌菌株121株，剔除同一患者同一部位分离菌，全部菌株均采用VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定药敏仪进行验证。菌株采用无菌纸片-20 ℃保存。选取肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶阳性对照质控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶阴性对照质控菌株，药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922

1.1.2 仪器与试剂 VITEK 2全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司产品）；血琼脂平皿（郑州安图生物工程股份有限公司 ）；美罗培南10 μg药敏片（康泰生物制品有限公司提供）；Muller-Hinton药敏培养平皿（广州市迪景微生物科技有限公司）；GeneAmpPCRsystem 2400热循环仪（美国Applied Biosystems Inc.）；DNA Marker DL2000（大连TaKaRa公司）；琼脂糖（美国Hydra Gene公司）；Goldviw（北京赛百盛生物技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验 经VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定仪进行鉴定和药敏试验，按照2015年的美国临床和实验室标准化协会（CLSI）的标准来判定鲍曼不动杆菌的耐药情况。

1.2.2 菌株复苏 从-20 ℃保存的菌株库找到相应菌株，确认无误后，用LB液体培养液进行振荡复苏，然后接种到血琼脂培养基上进行培养。

1.2.3 PCR扩增 DNA模板的制备：采用煮沸法，挑取在血培养上孵育18～24 h的数个菌落加入到有灭菌蒸馏水150 μL的EP管中，煮沸10 min后立即冷却于4 ℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板。OXA-23-F 5'GATCGGATTGGAG AACCAGA OXA-23-R 5'ATTTCTGACCGCATTT CCAT。目的片段501 bp。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 2 min，循环参数：变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，共循环30次，延伸72 ℃ 10 min。取6 μL PCR产物用含Goldview染料的1.5 %琼脂糖凝胶上电泳。然后在紫外成像仪上成像并记录结果。

1.2.4 碳青霉烯酶失活法（carbapenem inactivation method，CIM）[4]经LB培养基复苏过的鲍曼不动杆菌在血培养基上经过35 ℃过夜培养后，用10 μL接种环挑取满环加入到400 μL高压灭菌的蒸馏水中。振荡混匀后，加入10 μg美罗培南药敏片。35 ℃温育4 h后，在MH药敏平皿上均匀涂布0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC 25922，放置10 min后，将温育好的美罗培南药敏片取出，贴壁挤去多余的液体，贴到MH平皿上。35 ℃温育过夜观察结果。如果药敏片周围无抑菌环，则为阳性（产碳青霉烯酶），如果药敏片周围形成抑菌环，则为阴性（不产碳青霉烯酶）。

2 结果

2.1 细菌耐药情况

121株鲍曼不动杆菌中68株对亚胺培南和美罗培南均耐药，52株对亚胺培南和美罗培南均敏感。仅1株对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感。

2.2 PCR检测基因结果

121株鲍曼不动杆菌中PCR检测OXA-23 基因阳性69株，IMP、NDM、VIM、KPC基因检测均阴性。

2.3 耐药表型与OXA-23的关系3

121株鲍曼不动杆菌中，68株对亚胺培南和美罗培南均耐药，其中65株菌PCR显示携带OXA-23基因；52株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感，其中3株菌携带OXA-23基因；1株对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感，OXA-23为阳性。见表1。

表1 OXA-23的结果和耐药性分析Table 1 Resistant pattern and corresponding result of OXA-23 gene detection

2.4 CIM 检测结果与耐药表型分析

68株亚胺培南和美罗培南耐药鲍曼不动杆菌中，66株菌CIM试验呈阳性。52株亚胺培南和美罗培南敏感的菌株中，CIM全部呈阴性。1株亚胺培南耐药但美罗培南敏感菌株，CIM试验呈阴性。见表1。

2.5 CIM和OXA-23的结果比对

以OXA-23为标准，CIM阳性检测能力为65/69，阳性预测值为94.2 %，阴性检测能力为51/52，阴性预测值为98.1 %

3 讨论

由鲍曼不动杆菌导致的医疗相关感染（HAI），经常发生在病情非常严重的患者，鲍曼不动杆菌所致HAI可以将患者病死率从4 %增加到40 %[5]，特别是幸存的鲍曼不动杆菌获得了对多种药物耐药的能力。在我国台湾，耐药率从2003年的14 %上升到了2008年的46 %[6]。中国细菌耐药监测网（CHINET）报道2014年不动杆菌属（鲍曼不动杆菌占93.0 %）对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.4 %和66.7 %[7]，在我省据河北省细菌耐药监测网2013年数据统计表明耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为70.9 %和78.2 %[8]。高耐药率的鲍曼不动杆菌已经蔓延全球，特别是亚太地区和拉丁美洲， 治疗由鲍曼不动杆菌引起感染的抗菌药物选择越来越困难。

碳青霉烯类抗生素，经常被最后用来治疗多重耐药的革兰阴性杆菌，然而，随着过度使用碳青霉烯类抗生素，细菌对这类药物产生耐药，主要耐药机制是膜孔蛋白的缺失或下降导致膜通透性的降低；青霉素结合蛋白的改变；产碳青霉烯酶。尤以后者为主要的耐药机制[3]。由染色体介导低水平表达的OXA-51是其固有耐药基因，一般不会导致对碳青霉烯类抗生素耐药，但是如果在OXA-51基因上游插入ISAbal或者是ISAba9序列，会出现过度表达，从而对碳青霉稀类药物耐药[9]。在获得的碳青霉烯酶中，OXA群基因在全球最为普遍，在鲍曼不动杆菌中，有5大群OXA类碳青霉烯酶，包括OXA-23、 -40、 -58、 -143和-235群。这些基因本身对碳青霉烯类耐药影响比较小，但是当ISAbal. ISAba2. ISAba3. ISA18等在这些（除blaOXA24）基因的上游时使这些酶的表达量增加，导致对碳青霉烯类耐药。其中OXA-23群是鲍曼不动杆菌最为普遍的耐药基因[10]。本研究中，有68株对亚胺培南和美罗培南均耐药，其中65株OXA-23基因阳性，说明我们2所医院的鲍曼不动杆菌的主要碳青霉烯酶的基因型为OXA-23。

PCR是碳青霉烯酶基因检测的“金标准”，可以精确鉴定碳青霉烯酶的种类。目前直接进行碳青霉烯酶基因检测的技术有普通PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、环介导等温扩增（LAMP）、基因芯片等。PCR 缺点是成本较高，需要高的专业技能，只能检测已经确定的基因。CIM试验是由van der Zwaluw等[4]首先使用的一种新型的碳青霉烯酶表型检测方法。可以用来检测肠杆菌科细菌、不发酵糖革兰阴性杆菌（铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）是否产碳青霉烯酶。其原理是美罗培南由于碳青霉烯酶的水解作用而灭活，从而无法抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长。该方法成本低，实用性强，操作简单，不需要专业的设备和技能，而且不受细菌培养时间、药敏片孵育时间、药敏片生产厂商以及细菌是否产黏液的影响，结果易于解释。但是结果中抑菌环直径的大小是否与结果有关，有待探讨。Tijet等[11]应用此技术检测后发现抑菌环直径20 mm和6 mm，对结果解释无影响。本研究抑菌环直径大小在24～14 mm，尽管本研究未发现有不一致的结果，但是抑菌环直径仍然是一个需要探讨的问题。

本研究中，共检测121株鲍曼不动杆菌，其中有68株对亚胺培南和美罗培南均耐药，65株CIM和OXA-23均为阳性；2株CIM和OXA-23均为阴性，有可能是由于其他耐药机制如产AmpC酶或者超广谱β内酰胺酶（ESBL）、外膜通透性下降等原因造成的；1株CIM阳性，OXA-23阴性，尽管本研究同时检测了IMP、NDM、VIM、KPC基因，但是未见阳性，推测有可能是产其他类的碳青霉烯酶。有52株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感，其中49株CIM和OXA-23为阴性。1株鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感，CIM阴性，OXA-23阳性；3株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感，CIM阴性，OXA-23阳性，考虑到有可能是CIM试验使用的菌的浓度或者药敏纸片的选择问题，重复试验后CIM仍然是阴性，加大菌液的浓度，把美罗培南纸片更换为亚胺培南纸片后试验结果仍然是阴性，考虑可能是由于OXA-23酶活性比较弱。

本研究结果表明CIM的灵敏度和特异度分别达到了94.2 %和98.1 %，从方法评价应该是非常好的方法。本方法比PCR方法操作简单、消耗低、干扰因素少、结果易于解释等优点可以作为普通实验室筛查鲍曼不动杆菌是否产碳青霉烯酶的表型方法。在抗感染形势日趋严重的今天，快速而有效地诊断能够为临床及时应用及调整抗生素提供快速有效的依据。

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Application of carbapenem inactivation method in detection of carbapenemaseproducing Acinetobacter baumannii

NIU Cui, YANG Jing, SHI Dongyan. （Department of Laboratory Medicine, the Third Hospital of Xingtai, Xingtai Hebei 054000, China）

Objective To evaluate the utility of carbapenem inactivation method (CIM) in detecting carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii. Methods A total of 121 strains of A. baumannii were identified and subjected to antimicrobial susceptibility testing by VITEK compact. Carbapenem inactivation method (CIM) was applied to detect the carbapenemase in the A. baumannii strains. The OXA-23 type carbapenemase-encoding genes were analyzed by common PCR method. Results Six-eight of the 121 strains showed resistance to imipenem and meropenem. PCR showed that 65 of the 68 strains carried OXA-23 gene. CIM was positive in 66 of the 68 strains. And 52 of the 121 A. baumannii strains were susceptible to imipenem and meropenem. PCR showed that OXA-23 gene was negative in 49 of the 52 strains. CIM was negative in the 52 strains of non-carbapenemase-producing A. baumannii. Only one strain was resistant to imipenem but susceptible to meropenem. CIM was negative but QXA-23 was positive for this strain. The sensitivity and the specif city of CIM was 94.2% and 98.1% respectively in detecting carbapenemase-producing A. baumannii. Conclusions The results of CIM were consistent with the results obtained by PCR to detect the encoding gene of OXA-23. CIM is inexpensive, easier to operate and interpret than PCR method. CIM is applicable to detect OXA-23 type carbapenemase rapidly in A. baumannii.

Acinetobacter baumannii; carbapenem inactivation method; OXA-23 type carbapenemase

R378.99

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0052-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.010

2016-01-20

2016-04-10

1. 邢台市第三医院检验科，河北邢台 054000；

2. 河北医科大学第二医院检验科。

牛翠（1985—），女，硕士研究生，主管检验师，主要从事细菌学专业。

时东彦，E-mail: shidongyan73@126.com。