spo0A基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用

宋晓蕾， 周芬芬， 吴 湜， 高 琼， 黄海辉， 陈轶坚

·论著·

spo0A基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用

宋晓蕾， 周芬芬， 吴 湜， 高 琼， 黄海辉， 陈轶坚

目的 了解spo0A基因对艰难梭菌临床分离株生长和芽孢产生的影响。方法 采用ClosTron敲除技术构建艰难梭菌临床分离株C25的spo0A基因突变株，分光光度计检测菌液浓度并绘制生长曲线，孔雀绿染色法计数芽孢和营养细胞。结果 艰难梭菌临床分离株C25的spo0A基因敲除突变株和敲除前亲代株的48 h生长曲线无明显差异，但突变株不再产生芽孢。结论 spo0A基因是艰难梭菌芽孢形成过程中的关键基因，但并非其生长过程中的主要基因。

艰难梭菌； 芽孢； spo0A基因； 生长曲线

艰难梭菌（Clostridium diff cile）为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，是医院获得性腹泻最主要的病原菌，约25 %～33 %抗生素相关性腹泻以及90 %假膜性肠炎由艰难梭菌所致，统称为艰难梭菌感染（Clostridium diff cile infection， CDI）[1]。大多数的CDI发生在住院患者中，但近10年社区获得CDI急剧上升，约占新发感染的1/3[2]。

芽孢是艰难梭菌在外界环境中的主要存在形式，也是艰难梭菌感染广泛传播的原因之一。DNA结合蛋白Spo0A是细胞从营养生长期进入芽孢形成时期的关键应答调节蛋白。对模式微生物枯草芽孢杆菌的研究表明，当Spo0A的含量和磷酸化水平达到一定阈值后，芽孢形成才开始启动[3-4]。有报道Spo0A在艰难梭菌持续感染和传播中起重要作用[5-6]。本研究采用ClosTron技术构建艰难梭菌spo0A基因突变株，对Spo0A在艰难梭菌临床分离株生长和芽孢形成中的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 艰难梭菌临床株C25分离自我院腹泻患者粪便。经鉴定该菌株为核糖体014型，产A毒素和B毒素。VPI10463为实验室标准菌株，产A毒素和B毒素。大肠埃希菌感受态细胞HB101购自日本TaKaRa公司。pMTL007-E2质粒为英国诺丁汉大学Nigel Minton惠赠。

1.1.2 主要试剂 Brucella琼脂为美国BBL Microbiology system产品，蛋白胨-酵母基础肉汤（TY肉汤）和SAB肉汤为英国OXOID公司产品。环丝氨酸、头孢西丁等药物购自大连美仑生物技术有限公司。引物由DNA 2.0公司（美国）或上海生物工程技术服务有限公司合成。TargeTron gene knockout system kit为美国Sigma-Aldrich公司产品。孔雀绿为中国国药集团化学试剂有限公司产品。番红染液为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 构建艰难梭菌spo0A基因突变株 在http：//www.clostron.com中选取合适的目的基因突变位点，生成IBS、EBS2、EBS1d、EBS Universal引物序列，由DNA2.0 公司合成上述引物序列并进行PCR，纯化突变所需内含子片段，按TargeTron gene knockout system kit说明书操作完成该内含子片段与pMTL007-E2质粒的重组。将重组质粒导入E. coli HB101感受态细胞，氯霉素平皿筛选。将筛选后含有重组质粒的大肠埃希菌与亲代菌株混合培养进行接合实验。用甲砜霉素-头孢西丁-环丝氨酸平皿与红霉素平皿筛选艰难梭菌接合子[5,7]。在含红霉素的筛选平皿上随机挑取6个接合子菌落，采用3对验证引物进行PCR并测序。引物序列见表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and the corresponding oligonucleotide sequences in this study

1.2.2 绘制细菌生长曲线 纯分后的艰难梭菌菌株在厌氧工作站中（Ruskinn，英国）37 ℃培养16 h后取1 mL菌液加入到150 mL预还原TY肉汤中，置于摇床上厌氧培养，记为0 h。前18 h中每隔3 h从厌氧培养TY肉汤中取样3 mL，于紫外可见光分光光度计上测量D600值，之后于24 h、48 h取样测量D600值，绘制生长曲线。

1.2.3 计算产芽孢率 分别于第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取上述菌液1 mL，离心3 000×g，10 min，留取沉淀，加入适量PBS和5 %孔雀绿水溶液等量混合，100℃加热25 min，涂片，干燥，加热固定，ddH2O冲洗玻片，直至流出的水无色为止，用0.5 %番红溶液复染3 min，使用洗耳球吹去多余染液，吹干玻片。油镜下芽孢呈绿色，菌体呈红色。分别计数10个单独的视野。产芽孢率= 芽孢数/（ 芽孢数+ 营养细胞数）×100 %。

2 结果

2.1 艰难梭菌spo0Aspo0A突变株验证

用Cd-spo0A-F1/Cd-spo0A-R1引物进行PCR后，琼脂糖凝胶电泳显示突变株扩增产物的长度较亲代株长，测序结果证实该段序列中含有Ⅱ类内含子。用ErmRAM-F/ErmRAM-R引物PCR后其测序结果证实了RAM片段在突变过程中发生重组。用插入序列一端引物EBS Universal和spo0A基因一端引物Cd-spo0A-R1进行PCR后结果则进一步证实了spo0A基因中有内含子插入序列，突变株构建成功，见图1。

图1 艰难梭菌spo0A突变株验证Figure 1 PCR conf rmation of intron integration into spo0A gene

2.2 生长曲线

以实验室标准菌株VPI10463为对照，可见VPI10463、C25与C25 spo0A突变株生长情况相似，在前9 h均处于指数生长期，12 h后进入稳定生长期。各个时间点C25与C25 spo0A突变株菌液浓度也相仿，见图2。

图2 VPI10463， C25， C25 spo0A突变株生长曲线Figure 2 Growth curve of three Clostridium diff cile strains, VPI10463, C25 and C25 spo0A mutant

2.3 产芽孢率

VPI10463在48 h即开始有芽孢产生，产芽孢率0.3 %，而后随时间增长产芽孢率增加。C25菌株在48 h开始有芽孢产生，产芽孢率0.1 %，而后随时间增长产芽孢率亦增加。但C25 spo0A突变株至120 h均没有芽孢产生，见图3。

图3 spo0A基因对芽孢产生的影响Figure 3 Effect of spo0A gene inactivation on sporulation capacity of C. diff cile

3 讨论

艰难梭菌作为一种芽孢杆菌，可在恶劣的条件下产生芽孢，临床上营养缺乏、抗生素暴露、消毒剂的使用均可能使之产生芽孢。因此芽孢是艰难梭菌传播的主要形式，亦可能与艰难梭菌感染停药后反复发作相关[8]。文献报道欧美广泛传播的NAP1/BI/027菌株产芽孢能力明显高于其他菌株，且该菌株感染更容易复发[9]。因此当前很多研究者对艰难梭菌芽孢形成机制进行研究，以期为治疗艰难梭菌感染提供新靶点和新思路。

Spo0A是近年来研究的热点之一，其在营养细胞生长、芽孢产生、毒素分泌以及生物膜形成方面的作用均有报道[10]。但由于在艰难梭菌中基因敲除比较困难，因此基因功能研究明显落后于其他病原菌，直至2007年Nigel Minton教授研发并共享ClosTron技术[11]。本课题组亦是在Nigel Minton惠赠关键质粒后方成功敲除spo0A基因。

本研究发现spo0A基因敲除前后突变菌株与亲代菌株的生长趋势相仿，均在9 h后进入稳定生长期，且各个生长阶段吸光度值D600均相近，表明spo0A基因并非艰难梭菌C25菌株生长过程中的主要基因。虽Pettit等[6]研究显示部分与细胞壁合成相关的基因也受Spo0A调控，但敲除spo0A基因对于艰难梭菌营养细胞的生长并无明显影响。

本研究中艰难梭菌临床分离株C25和实验室标准菌株VPI10463在TY肉汤中培养48 h即开始产生芽孢，之后随着培养时间的延长产芽孢率明显增加，但C25 spo0A突变株在整个研究阶段均无芽孢产生，提示Spo0A是艰难梭菌芽孢产生的必要蛋白。这与其他研究者的结果相一致：Mackin等[12]、Underwood 等[7]和Deakin等[5]对spo0A基因敲除后的027、 078、630 Δerm的研究均发现spo0A基因敲除后突变株不产生芽孢。并且Deakin等[5]还发现spo0A基因敲除后突变株在小鼠中的传播和持续感染均受到影响，可能与spo0A基因敲除后艰难梭菌芽孢产生障碍有关。

本研究的局限在于未进行spo0A基因回补试验，且仅敲除核糖体型014菌株。今后将增加不同核糖体型别的研究菌株，特别是国内主要的核糖体型017流行株；增加回补实验及动物实验，为了解Spo0A在艰难梭菌感染发病和传播中的作用提供更多依据。

[1] LESSA FC， WINSTON LG， MCDONALD LC. Burden of Clostridium diff cile infection in the United States[J]. N Engl J Med，2015，372（24）：2369-2370.

[2] KHANNA S， PARDI DS， ARONSON SL， et al. The epidemiology of community-acquired Clostridium difficile infection： a population-based study[J]. Am J Gastroenterol，2012，107（1）：89-95.

[3] 孙静，陈建华. 枯草芽孢杆菌形成芽孢时母细胞中基因表达的调控[J]. 生物技术，2007，17（3）：79-83.

[4] 刘燕，秦玉昌，潘宝海. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在芽孢形成过程中的几个关键事件[J]. 生命科学，2005，17（4）：360-363.

[5] DEAKIN LJ， CLARE S， FAGAN RP， et al. The Clostridium diff cile spo0A gene is a persistence and transmission factor[J]. Infect Immun，2012，80（8）：2704-2711.

[6] PETTIT LJ， BROWNE HP， YU L， et al. Functional genomics reveals that Clostridium diff cile Spo0A coordinates sporulation，virulence and metabolism[J]. BMC Genomics，2014，15：160.

[7] UNDERWOOD S， GUAN S， VIJAYASUBHASH V， et al. Characterization of the sporulation initiation pathway of Clostridium difficile and its role in toxin production[J]. J Bacteriol，2009，191（23）：7296-7305.

[8] GERDING DN， JOHNSON S. Clostridium diff cile infection in 2010： advances in pathogenesis， diagnosis and management of CDI[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8（2）：67-68.

[9] MERRIGAN M， VENUGOPAL A， MALLOZZI M， et al. Human hypervirulent Clostridium difficile strains exhibit increased sporulation as well as robust toxin production[J]. J Bacteriol，2010，192（19）：4904-4911.

[10] PAREDES CJ， ALSAKER KV， PAPOUTSAKIS ET. A comparative genomic view of clostridial sporulation and physiology[J]. Nat Rev Microbiol，2005，3（12）：969-978.

[11] HEAP JT， CARTMAN ST， KUEHNE SA， et al. ClosTrontargeted mutagenesis[J]. Methods Mol Biol，2010，646：165-182.

[12] MACKIN KE， CARTER GP， HOWARTH P， et al. Spo0A differentially regulates toxin production in evolutionarily diverse strains of Clostridium diff cile[J]. PLoS One，2013，8（11）：e79666.

The role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile

SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile clinical isolates. Methods ClosTron gene knock-out system was used to knock out the spo0A gene of C. difficile strain C25. Bacterial growth curve was plotted by measuring D600with spectrophotometer in different phases of bacterial growth. Malachite green staining technique was used to count the number of vegetative cells and spores under optical microscope. The sporulation rate was calculated. Results The spo0A mutant and its C25 parental strain showed similar patterns of growth. However, after knock-out of spo0A gene, an asporogenous phenotype was built, while the parental strain could produce spores as usual. Conclusions The spo0A gene plays a key role in sporulation but not growth of C. diff cile strain.

Clostridium diff cile; sporulation; spo0A gene; growth curve

R378.8

A

1009-7708 ( 2017 )01-0033-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.006

2016-07-13

2016-07-20

国家自然科学基金项目(30973594)。

复旦大学附属华山医院抗生素研究所，卫生部抗生素临床药理重点实验室，上海 200040。

宋晓蕾（1988—），女，硕士研究生，主要从事感染性疾病的诊断治疗。

陈轶坚，E-mail：chenyijian@fudan.edu.cn。