喹诺酮类耐药福氏志贺菌的相关耐药基因研究

张雯霞， 张 珏， 陈洪友， 屠丽红， 陈 敏

·论著·

喹诺酮类耐药福氏志贺菌的相关耐药基因研究

张雯霞1， 张 珏1， 陈洪友2， 屠丽红2， 陈 敏2

目的 了解2010－2014年上海市各区县医院139株福氏志贺菌的耐药性，探讨福氏志贺菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法 用纸片扩散法测定菌株对14种抗菌药物的敏感性，用环丙沙星E试验条测定其最低抑菌浓度；采用PCR法检测DNA旋转酶A亚单位（gyrA）、拓扑异构酶Ⅳ C亚单位（parC）基因的喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR），同时对质粒介导喹诺酮类耐药（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷乙酰转移酶变异基因aac（6'） -Ib-cr进行筛选。扩增产物进行DNA测序。结果 福氏志贺菌对氨苄西林、链霉素、四环素、萘啶酸的耐药率都达到了90 %以上，对环丙沙星的耐药率达到了40.3 %，同时有30.2 %菌株对头孢吡肟产生了耐药。gyrA和parC基因的突变率分别为98.6 %和97.8 %。gyrA基因存在Ser83、Asp87和His211 3个位点的突变，parC基因只检测到Ser80 1个位点的突变；共检测到9株qnrS和6株aac（6'） -Ib-cr喹诺酮耐药质粒。结论 上海地区福氏志贺菌耐药情况严重。QRDR相关基因突变率高，Asp87的突变对喹诺酮类抗菌药物的耐药起着主导作用，而耐药质粒起着重要的辅助作用。

志贺菌； 喹诺酮类； 耐药基因

细菌性痢疾是全世界范围内流行的最常见的腹泻性疾病之一，亚洲每年感染志贺菌的患者约

1.25 亿例，死亡人数达1.4万例[1]。合理的抗菌治疗可有效减轻症状，降低并发症发生的风险。氟喹诺酮类药物一直是临床治疗细菌性痢疾的一线抗菌药物。然而随着此类药物的广泛应用，志贺菌对氟喹诺酮类药物的耐药性不断增加，特别是福氏志贺菌的耐药情况更加严重。为了解福氏志贺菌的耐药情况和对喹诺酮药物的耐药机制，本研究对2010―2014年从上海各区县医院临床分离的139株福氏志贺菌进行了抗菌药物敏感性试验，并对喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR）相关基因，即DNA旋转酶A亚单位（gyrA）、拓扑异构酶ⅣC亚单位（parC）进行检测，对质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'） -Ib-cr进行筛选。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集上海市各区县医院2010－2014年从门诊腹泻患者中分离得到139株福氏志贺菌，经法国生物梅里埃VITEK2生化鉴定仪鉴定，并用日本Denka Seiken生研公司的志贺菌诊断血清进行血清学确认。PMQR基因PCR筛选的qnrA、qnrB、qnrS和aac （6'） -Ib-cr阳性对照株均由复旦大学附属华山医院抗生素研究所赠送。

1.1.2 仪器和试剂 药敏纸片、MH琼脂、E试验条购自英国OXOID公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司； TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、TaKaRa DL2000 DNA Maker、Agarose琼脂糖购自宝生物工程（大连）有限公司；溴化乙锭（EB）购自美国Sigma公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要仪器包括PCR基因扩增仪（Bio-Rad DNA Engine Dyad）、脉冲场凝胶电泳仪（Bio-Rad CHEF Mapper）、凝胶成像系统（Bio-Rad GEL Doc2000）。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性试验 药物敏感性试验采用改良的纸片扩散法和最低抑菌浓度法。抗菌药物包括氨苄西林、环丙沙星、头孢噻肟、头孢吡肟、甲氧苄啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、阿莫西林-克拉维酸、氯霉素、头孢西丁、萘啶酸、诺氟沙星、链霉素、四环素、磺胺复合物等14种。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，结果判断参照2015年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准[2]。

1.2.2 PCR扩增试验 细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，PCR法检测QRDR相关基因gyrA、parC和PMQR基因qnrA、qnrB、qnrS、aac（ 6'） -Ib-cr。引物序列长度及退火温度见表1[3-8]，扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 1 min，54～61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃，4 min。PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳，EB染液染色，在紫外灯下观察结果，且采用GEL Doc 2000凝胶成像系统凝胶成像，出现与阳性对照相当的目的条带即判为阳性。

1.2.3 DNA测序 PCR扩增产物原液送上海迈浦生物科技有限公司双向测序。测序结果经拼接后在GenBank中经BLAST进行比对分析。gyrA、parC以福氏志贺菌F2a 301（GenBank中的参比号为AE005674）作为参比菌株。

2 结果

2.1 药物敏感性试验

139株福氏志贺菌对14种抗菌药物的敏感性试验结果显示志贺菌的耐药情况严重，对氨苄西林、链霉素、四环素、萘啶酸的耐药率在90 %以上，分别为94.2 %、95.0 %、93.5 %和98.6 %。对喹诺酮类抗菌药物环丙沙星的耐药率达到了40.3 %，同时有30.2 %菌株对第四代头孢菌素头孢吡肟产生了耐药，见表2。

2.2 QRDR相关基因的突变分析

139株福氏志贺菌中， 137株菌株发生了gyrA基因的突变，突变率达到了98.6 %；有136株菌株发生了parC基因的突变，突变率达到了97.8 %。gyrA基因检测到Ser83、Asp87和His211这3个位点的点突变，其中Ser83→Leu位点突变的有137株，Asp87→Asn位点突变有48株，Asp87→Gly位点突变有15株，His211→Tyr位点突变有131株。ParC基因只检测到Ser80这一个位点的点突变，其中有132株表现为Ser80→Ile位点突变，4株表现为Ser80→Arg的位点突变。

139株菌株中，仅有2株未检测到QRDR任何氨基酸的突变，其环丙沙星的MIC分别为0.006和0.016 mg/L，见表3。发生氨基酸突变的137株福氏志贺菌中有136株呈现出gyrA和parC 2个亚基的同时突变，仅有1株只表现为gyrA基因的突变。其中有45株菌株有gyrA基因的Ser83、Asp87、His211 3个位点和parC基因Ser80位点的同时突变，占32.4 %，其环丙沙星的MIC为2～24 mg/L；最为普遍的是gyrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80这3个位点的突变，占50.4 %（70/139），其环丙沙星的MIC为0.19～32 mg/L。

56株环丙沙星耐药的福氏志贺菌中，有44株表现为Ser83、Asp87、His211和Ser80这4个位点的同时突变，占81.5 %，而在环丙沙星敏感菌株中没有出现4个位点的同时突变。64株环丙沙星敏感的福氏志贺菌中，有90.6 %的菌株表现为Ser83、His211和Ser80这3个位点的同时突变。所有环丙沙星敏感的菌株均未出现gyrA基因的Asp87位点的突变。

表1 喹诺酮类耐药相关基因引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying the genes related to quinolone resistance

表2 139株福氏志贺菌对14种抗菌药物的耐药率和敏感率Table 2 Susceptibility of 139 strains of Shigella f exneri to 14 antimicrobial agents（%）

表3 志贺菌QRDR氨基酸突变和喹诺酮类药物耐药性关系Table 3 Relationship of amino acid mutations in QRDR and resistance to quinolones

2.3 喹诺酮耐药质粒的鉴定

139株福氏志贺菌中，检测到9株qnrS和6株aac （6'） -Ib-cr喹诺酮耐药质粒，分别占6.5 %和

4.3 %，见表4，未检测到qnrA和qnrB基因。qnrS测序结果在NCBI GenBank上进行同源性比对，其基因核苷酸序列均与注册号为KP773319的qnrS1基因序列号同源性为100 %。携带有PMQR基因的菌株，其环丙沙星的MIC为0.5～32 mg/L，同时均伴有gyrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80这3个位点的突变，除了菌株SH12-13和SH12-33同时伴有gyrA基因的Ser83、Asp87、His211 3个位点和parC基因Ser80位点的突变。

3 讨论

氟喹诺酮类一直是临床治疗细菌性痢疾的常用抗菌药物，随着氟喹诺酮类药物在临床以及农业、畜牧业的长期使用，其耐药率近年来有明显的上升趋势。最近美国CDC通过对2014年5月到2015年2月的宋内志贺菌进行分析，发现其对环丙沙星的耐药率达到了87 %[9]。本研究显示，福氏志贺菌对环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别达到了40.3 %、27.3 %和11.5 %。这就提示我们有必要对志贺菌进行长期的耐药监测，以指导临床进行有效用药。

氟喹诺酮类的耐药主要是DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的QRDR发生突变所致[10-11]，通常在gyrA基因的Ser83和Asp87氨基酸残基突变的基础上，进一步发生parC基因的Ser80和Glu84氨基酸残基的替换才会导致肠杆菌科细菌对喹诺酮类药物高水平耐药[12]。本研究对139株福氏志贺菌的研究发现，所有菌株gyrA基因的83位丝氨酸都被亮氨酸所替换，并且同时存在其他位点的突变，除了SH10-35和SH14-1这2株未检测到QRDR任何氨基酸的突变，其环丙沙星的MIC分别为0.006和0.016 mg/L。gyrA基因除了Ser83和Asp87这2个位点突变之外，同时检测到His211这个位点的突变，其突变率达到了94.2 %（131/139）。His211→Tyr的氨基酸改变是新发现的突变位点，乌拉圭于2014年在福氏志贺菌中最新检测到这个位点的突变[13]，在国内未曾有过报道。可见，上海地区福氏志贺菌在QRDR区氨基酸的突变率极高。

64株环丙沙星敏感菌株中，均未检测到gyrA基因Asp87这个位点的突变；56株环丙沙星耐药菌株中，只有9株未检测到Asp87的突变。可见Asp87这个位点的突变对喹诺酮类的耐药起着主导作用。首先是gyrA基因Ser83发生突变，如果联合His211或/和parC基因Ser80的突变，菌株对于喹诺酮类的敏感率就会下降。一旦发生gyrA基因Asp87的突变就很有可能导致菌株对喹诺酮类的耐药。之前的研究表明gyrA基因中Ser83和Asp87的双重突变与福氏志贺菌对喹诺酮类的耐药密切相关[14]，我们的结论与之相符。本研究中发现，64株环丙沙星敏感的福氏志贺菌中，有90.6 %的菌株表现为Ser83、His211和Ser80这3个位点的同时突变，如果再合并Asp87氨基酸的突变，那就会导致菌株对喹诺酮类的耐药。

PMQR是近10年来新发现的细菌耐药机制，耐药质粒是染色体之外，具有独立自主遗传功能的双链DNA，通过接合转移、转化、转导、转座及整合等方式进行水平传播，并可编码一种或多种抗菌药物的耐药性，从而传播耐药性。目前已报道的PMQR包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6'）-Ib-cr和qepA。其中携带qnr基因的喹诺酮耐药质粒在世界范围流行。在杭州，15株喹诺酮耐药的志贺菌中检测到5株携带qnrS耐药质粒，2株携带aac（6'）-Ib-cr耐药质粒[10]。在安徽，53.8 %（14/26）志贺菌检测到喹诺酮耐药质粒，其中qnrA1、qnrS1、qnrS2、aac（6'） -Ib-cr和qepA分别占30.8 %、11.5 %、3.8 %、19.2 %和11.5 %[15]。在河南，293株志贺菌中检测到6株携带有qepA基因，19株携带有aac（6'）-Ib-cr基因，分别占2.05 %和6.48 %[3]。本研究中，139株福氏志贺菌中检测到qnrS基因和aac（6'）-Ib-cr各9和6株，分别占6.5 %和4.3 %，未检测到qnrA和qnrB基因。可见，携带有喹诺酮类耐药质粒的志贺菌在中国存在的年代已久，因其能够进行水平传播，故质粒所介导的耐药菌株在不断的扩散和蔓延。同时，PMQR基因对染色体介导的喹诺酮类耐药起重要的辅助作用，使细菌更容易发生高水平的耐药[16]。在本研究中，9株87位没有氨基酸改变却对环丙沙星耐药的菌株中有7株携带有喹诺酮耐药质粒aac（6'）-Ib-cr或qnrS1，更加证实了这一结论。也有研究表明，在各耐药质粒中，qnrS基因在菌株的耐药中起到主导作用[17-18]。我们的试验结果也与之相符：9株携带有qnrS耐药质粒的菌株其环丙沙星的MIC均要高于携带有aac（6'）-Ib-cr耐药质粒的菌株，除了有1株菌株SH10-48，其环丙沙星的MIC达到了32 mg/L，而其携带的是aac（6'）-Ib-cr耐药质粒，可能是这株菌株同时存在着其他耐药机制，导致对喹诺酮类药物的高度耐药，值得我们进一步去研究和探讨。

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Genes conferring quinolone resistance in Shigella f exneri

ZHANG Wenxia, ZHANG Jue, CHEN Hongyou, TU Lihong, CHEN Min. （Department of Clinical Laboratry, Shanghai Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditionaly Chinese Medicine, Shanghai 201203, China）

Objective To investigate the antimicrobial resistance prof le of Shigella f exneri in Shanghai from 2010 to 2014 and examine the mechanism of f uoroquinolone resistance. Methods Kirby-Bauer method was used to determine the susceptibility of the S. f exneri strains to 14 antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ciprof oxacin was tested by E-test. Mutations within quinolone resistance determining regions (QRDR) of gyrA and parC and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes, qnrA, qnrB, qnrS and aac(6')-Ib-cr were identif ed by polymerase chain reaction (PCR). All the products were subjected to sequencing analysis. Results More than 90 % of the 139 S. f exneri isolates were resistant to ampicillin, streptomycin, tetracycline, and nalidixic acid, 40.3 % to ciprof oxacin and 30.2 % to cefepime, respectively. Genetic mutation of gyrA and parC was found in 98.6 % and 97.8 % of the strains, respectively. Three point mutations (Ser83, Asp87 and His211) were detected in gene gyrA and one point mutation (Ser80) was found in in gene parC. Plasmid-mediated resistant gene qnrS was found in 9 strains and aac(6')-Ib-cr in 6 strains. Conclusions The antibiotic resistance of S. f exneri is serious in Shanghai. The mutation rate within QRDR is high. Point mutation in Asp87 of gyrA is the main mechanism of quinolone resistance. The plasmid-mediated quinolone-resistant genes also play an important supplementary role.

Shigella; quinolone; resistant gene

R378.22

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0046-06

10.16718/j.1009-7708.2017.01.009

2016-01-15

2016-02-19

上海市公共卫生重点学科卫生微生物学（12GWZX 0801）。

1. 上海中医药大学附属曙光医院检验科，上海 201203；2. 上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室。

张雯霞（1981—），女，硕士，主管技师，主要从事肠道致病菌耐药机制研究。

陈敏，E-mail：chenmin@scdc.sh.cn。