IL-18对胰腺星状细胞及其趋化因子CX3CL1表达的影响

2017-02-20王茜陈浩宇陈洁

中华胰腺病杂志 2017年1期

王茜陈浩宇陈洁

·论著·

王茜陈浩宇陈洁

目的观察IL-18对胰腺星状细胞E-钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及趋化因子CX3CL1表达水平的影响。方法人胰腺星状细胞(PSCs)株HPaSteC常规培养、传代，应用5、25、50、100 μg/L IL-18干预72 h，以未干预细胞为对照组。收集各组细胞，采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测细胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA及蛋白表达量。结果对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs的E-cadherin mRNA表达量分别为1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06；α-SMA mRNA表达量为1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09；CX3CL1 mRNA表达量为1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13。干预组E-cadherin mRNA的表达下调，α-SMA及CX3CL1mRNA表达上调，其中100 μg/L干预组与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs的E-cadherin蛋白表达量分别为1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06；α-SMA蛋白表达量为1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02；CX3CL1蛋白表达量分别为1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。干预组E-cadherin蛋白表达下调，但各组间的差异无统计学意义；α-SMA蛋白表达上调，25、50、100 μg/L IL-18干预组与对照组的差异有统计学意义(P值均<0.01)；CX3CL1蛋白表达上调，其中100 μg/L干预组与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-18能激活人PSCs并上调PSCs趋化因子CX3CL1的表达。

胰腺；星形细胞；胰腺炎，慢性；趋化因子CX3CL1；白细胞介素18

Fund program：Youth Science Foundation，National Natural Science Foundation of China(81300352)

胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells，PSCs)不仅能分泌多种炎性因子和趋化因子参与炎性过程，而且能分泌胶原，在组织再生和纤维化中发挥关键作用[1]。PSCs一般处于静息状态，不表达α-平滑肌肌蛋白(α-SMA)，但被激活后α-SMA表达增加[2]。PSCs的激活是胰腺发生纤维化的主要原因。趋化因子CX3CL1在急性胰腺炎(AP)及慢性胰腺炎(CP)中发挥重要作用。研究发现，急性坏死性胰腺炎大鼠及CP患者的血清CX3CL1水平升高[3]。饮酒的CP患者血清CX3CL1水平升高更显著，因酒精协同刺激PSCs分泌CX3CL1[4]，提示血清CX3CL1水平升高可能具有致病作用。IL-18是IL-1家族的细胞因子，有免疫反应调节作用[5]。IL-18作用于Th1细胞，刺激干扰素-γ和其他细胞因子的产生，可能通过激活PSCs和上调趋化因子CX3CL1表达参与CP的胰腺纤维化过程。本研究应用不同浓度IL-18干预PSCs，观察E-钙黏素(E-cadherin)、α-SMA、CX3CL1 mRNA和蛋白表达量的变化，探讨IL-18的作用机制。

材料与方法

一、IL-18干预人PSCs

人PSCs株HPaSteC购自Science Cell公司，常规培养、传代。取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔5×105个细胞。培养至细胞融合度达80%后在各孔中分别加入终浓度为5、25、50、100 μg/L的IL-18(Biovision公司)，以未干预细胞作为对照组，孵育72 h后收集细胞。

二、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表达量的检测

收集IL-18干预72 h的细胞，用TRIzol(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，采用RT试剂盒(Fermentas公司)逆转录成cDNA，采用实时PCR法检测各组细胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表达量，按试剂盒说明书进行操作。E-cadherin正义序列5′-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3′，反义序列5′-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3′，扩增产物109 bp；α-SMA正义序列5′-CTGCTGAGCGTGAGATTGTC-3′，反义序列5′-TCAAGGGAGGATGAGGATGC-3′，扩增产物103 bp；CX3CL1(FKN)正义序列5′-ACCACGGTGTGACGAAATG-3′，反义序列5′-TGTTGATAGTGGATGAGCAAAGC-3′，扩增产物82 bp；内参GAPDH正义序列5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反义序列5′-GCCATCACGCCACAGTTC-3′，扩增产物101 bp。引物由华大基因设计并合成。PCR反应条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环。用illumina eco实时荧光定量PCR仪自带软件获得Ct值，以对照组细胞的表达量为1，采用公式2-△△Ct计算IL-18干预组细胞 E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

三、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表达量的检测

收集上述各组细胞，常规提取总蛋白，BCA 法定量蛋白后行蛋白质印迹法检测E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表达量，以Tubulin为内参。小鼠抗人E-cadherin一抗购自Proteintech公司，工作浓度1∶8 000；小鼠抗人α-SMA一抗购自Abcam公司，工作浓度1∶300；小鼠抗人CX3CL1一抗购自Proteintech公司，工作浓度1∶500；小鼠抗人Tubulin购自Sigma公司，工作浓度1∶5 000；HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记兔抗羊二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，工作浓度1∶50 000。ECL底物液购自Thermo公司。应用Image J软件进行条带扫描，以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

四、统计学处理

结果

一、各组E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表达量

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs的E-cadherin mRNA表达量分别为1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06，呈浓度依赖性下降趋势，其中100 μg/L干预组与对照组的差异有统计学意义(t=3.08，P<0.05)。

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs 的α-SMA mRNA表达量分别为1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09，呈浓度依赖性升高趋势，其中100 μg/L干预组与对照组的差异有统计学意义(t=4.27，P<0.05)。

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs 的CX3CL1 mRNA表达量分别为1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13，5、25 μg/L IL-18干预组表达量低于对照组，50、100 μg/L干预组表达量高于对照组，其中100 μg/L干预组与对照组的差异有统计学意义(t=5.32，P<0.01)。

二、各组E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 蛋白表达量(图1)

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs 的E-cadherin 蛋白表达量分别为1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06，呈浓度依赖性下降趋势，但各组间的差异无统计学意义。

图1 对照组(1)及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组(2、3、4、5)PSCs的E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表达

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs的α-SMA蛋白表达量分别为1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02，呈浓度依赖性升高趋势，25、50、100 μg/L IL-18干预组与对照间差异有统计学意义(t值分别为9.90、7.88、26.84，P值均<0.01)。

对照组及5、25、50、100 μg/L IL-18干预组PSCs的CX3CL1蛋白表达量分别为1.00±0.05、1.03±0.05，1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12，呈浓度依赖性升高趋势，其中100 μg/L干预组与对照组的差异有统计学意义(t=3.40，P<0.05)。

讨论

目前为止，人们对于CP发病机制的了解还处于探索阶段。趋化因子CX3CL1是CX3C家族独特成员,是一种具有黏附功能的炎性趋化因子，它参与肾脏纤维化的病理生理过程[6]。本课题组曾报道[7]，CP大鼠的胰腺腺泡细胞、胰腺导管上皮细胞、炎症细胞、胰岛细胞及α-SMA阳性的活化PSCs均高表达IL-18和CX3CL1，提示IL-18和CX3CL1可能参与CP的纤维化进程。田轶伦和姜德谦[8]应用25、50、100 μg/L IL-18干预人脐静脉内皮细胞，结果显示IL-18能够上调CX3CL1的表达并增强内皮细胞的趋化作用。Schneider等[9]报道，CP患者血清IL-18水平显著升高。王丽敏等[10]报道，IL-18可能通过上调CX3CL1的表达增强其趋化作用来参与炎性反应。PSCs激活后CX3CL1表达增加，进一步促进胰腺纤维化形成。

本研究结果显示，100 μg/L IL-18干预能够促进α-SMA mRNA和蛋白表达增加，刺激PSCs激活；同时上调PSCs的CX3CL1表达，参与胰腺纤维化进程。关于CX3CL1表达上调机制的研究，目前相对较少。Uchida1等[5]报道，酒精通过激活PSCs的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和解联蛋白-金属蛋白酶结构域17(a disintegrin and metalloprotease domain，ADAM17)，协同刺激PSCs释放CX3CL1，ERK/ MAPK参与CX3CL1基因转录和产物分泌，但也存在其他因素参与的可能，如NF-κB或者干扰素调节因子[5]。关于PSCs激活后CX3CL1表达上调机制还有待更多研究。

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[2] Phillips PA, McCarroll JA, Park S, et al. Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover[J]. Gut, 2003,52(2):275-282.

[3] Huang LY, Chen P, Xu LX, et al. Fractalkine as a marker for assessment of severe acute pancreatitis[J]. J Dig Dis, 2012,13(4):225-231.DOI: 10.1111/j.1751-2980.2012.00580.x.

[4] Uchida M, Ito T, Nakamura T, et al. ERK pathway and sheddases play an essential role in ethanol-induced CX3CL1 release in pancreatic stellate cells[J]. Lab Invest, 2013,93(1):41-53.DOI:10.1038/labinvest.2012.156.

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[7] 陈浩宇, 王茜, 陈洁. IL-18及趋化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纤维化中的表达及其意义[J]. 中华胰腺病杂志, 2016,16:115-118.DOI:10.3760/cma.j.issn.1647-1935.2016.02.009.

[8] 田轶伦, 姜德谦. 白细胞介素-18对Fractalkine表达和趋化作用的影响[J]. 实用预防医学, 2009,16:672-675.

[9] Schneider A, Haas SL, Hildenbrand R, et al. Enhanced expression of interleukin-18 in serum and pancreas of patients with chronic pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(40):6507-6514.

[10] 王丽敏, 李春玉, 张佳滨,等.分形素趋化因子在肾脏纤维化大鼠肾组织中的表达及IL-18结合蛋白对其表达的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2013,15:1134-1138.DOI:10.7499/j.issn.1008-8830.2013.12.024.

(本文编辑：屠振兴)

The influence of IL-18 on pancreatic stellate cells and CX3CL1 expression

WangQian,ChenHaoyu,ChenJie.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Objective To evaluate the effect of IL-18 on the expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 in pancreatic stellate cells(PSCs). Methods The human PSC line HPaSteC was routinely cultured and passaged. Five, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 was used to treat PSCs for 72 h and the untreated PSCs were used as control. Treated and untreated cells were both collected, and RT-PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 respectively. Results The mRNA expressions of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.03±0.17, 0.77±0.15, 0.89±0.12, 0.54±0.11 and 0.46±0.06. The mRNA expression of α-SMA were 1.03±0.19, 0.85±0.14, 1.33±0.22, 1.60±0.14 and 1.94±0.09；The mRNA expression of CX3CL1 were 1.01±0.08, 0.88±0.25, 0.86±0.17, 1.58±0.26 and 1.83±0.13. The mRNA expression of E-cadherin in IL-18 treated group were down-regulated , while the mRNA expression of α-SMA and CX3CL1 were up-regulated, and the differences between control and IL-18 100 μg/L treated group were statistically significant (P<0.05 or <0.01). The protein expression of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.00±0.14，1.14±0.04, 1.14±0.07, 0.85±0.08 and 0.80±0.06. The protein expression of α-SMA were 1.00±0.02, 0.77±0.07, 1.29±0.02, 1.59±0.07 and 1.70±0.02；The protein expression of CX3CL1 were 1.00±0.05, 1.03±0.05, 1.37±0.06, 1.46±0.18 and 1.45±0.12. The protein expression of E-cadherin was down-regulated but no significant differences were observed among different groups. The protein expression of α-SMA was up-regulated and the differences between control group and 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated groups were statistically significant (allP<0.01). The protein expression of CX3CL1 was up-regulated and the differences between control group and 100 ng/ml IL-18 treated group were statistically significant (P<0.05). Conclusions IL-18 can activate PSCs and up-regulate the expression of chemokine CX3CL1.

Pancreas; Astrocytes; Panceatitis, chronic; Chemokine CX3CL1; Interleukin-18

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.008

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

陈洁，Email: jiechen0115@sohu.com

国家自然基金青年科学基金项目(81300352)

2016-09-19)