脑梗死患者血清补体测定及其意义

张洪欣，张国军，康熙雄

·技术与方法·

脑梗死患者血清补体测定及其意义

张洪欣，张国军，康熙雄

脑梗死是脑血管病变（动脉粥样硬化或栓塞）所致缺血性卒中，具体的发病机制尚不明确[1]。有研究表明，补体系统激活是造成缺血性再灌注损伤的主要原因[2]。补体通过3 条途径激活，即经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径。以往的大量动物实验已经表明，在梗死区域有大量补体成分的沉积，本实验通过检测经典途径标志物 C1q、经典和凝集素共同标志物 C4d 以及终末产物 SC5b-9 在脑梗死患者血清中的含量及其变化，探讨补体系统激活在脑梗死患者病情进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取 2015年6月–2016 年3月在本院神经内科治疗的脑梗死初发病例 52 例，记为初发病例组，患者入选条件：①诊断均符合 1995 年第 4 届全国脑血管病学术会议修订的诊断标准；②均为初次发病，且经头颅 CT 或MRI 证实为脑梗死。排除标准：①发病前有脑血管病病史；②发病前 2 周内有感染性疾病；③患有恶性肿瘤、血液病、风湿免疫疾病、急性感染、严重肝肾功能不全或严重营养不良。同时选取颈动脉粥样硬化斑块患者 32 例（记作斑块组）做阳性对照，本院体检中心 32 例作正常对照，排除感染、高血压、糖尿病、高血脂及心肝肾等疾病。另选取脑血管病中心收住院脑梗死患者 15 例（记作动态监测组）及正常人5 例做正常对照，所有患者及正常人均符合以上入选标准。所有患者入院前未进行抗凝及抗血小板聚集药物治疗。

1.2 主要材料

补体 C1q 购自奥巴林（北京）生物科技有限公司，试剂盒批号为 20121217，稀释倍数为 5；补体 C3、C4 购自德国 Siemens 公司，试剂盒批号为 153317A，稀释倍数为20；补体 C4d、SC5b-9 购自上海邦奕生物科技有限公司，试剂盒批号为 201605、201604，稀释倍数为 5。

1.3 方法

1.3.1 临床资料 收集整理脑梗死患者、颈动脉粥样硬化斑块组的患者及正常对照者的一般资料（如年龄、性别等）及生化指标如葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸（脑梗死患者的多重危险因素）及总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮（肝肾功能）等。

1.3.2 血清标本采集 初发病例组在确诊当时留取静脉血7 ml，斑块组及正常对照组均于早晨空腹采肘静脉血 7 ml。动态监测组分别在发病的 6 h、12 h、24 h、36 h、3 d、5 d、7 d 留取静脉血 7 ml。采血后迅速于 4 ℃，3500 r /min 离心 10 min，取上清冻存于 –80 ℃ 冰箱备用。

1.3.3 血清中补体的检测 在 37 ℃ 迅速解冻标本，冻融标本立即冰上转移，以阻止稀释前补体活化。采用免疫透射比浊法测定补体 C1q、散射比浊法测定补体 C3、C4，双抗体夹心 ELISA 测定补体 C4d、SC5b-9。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 研究对象的一般资料和临床数据分析

3 组研究对象之间年龄分布无明显差异，而性别分布有所不同，脑梗死患者男性明显多于女性，考虑与男性患者存在吸烟、饮酒等加速血管病变的危险因素相关。其余肝肾功能相关指标则无明显差异（表 1）。

2.2 血清补体因子水平

检测血清中各补体因子水平，乘以各稀释倍数得到最终结果（表 2）。补体 C1q、C3、C4d、SC5b-9 的水平在 3 组之间比较有明显差异（P ＜ 0.05）。其中经典激活途径产物C1q、经典及凝集素途径共同产物 C4d、终末产物 SC5b-9在初发病例组和正常组间差异有统计学意义（P ＜ 0.05），C1q、C3、C4d 在斑块组和正常组间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。而经典及凝集素途径共同产物 C4、终末产物SC5b-9 在初发病例组和斑块组间差异无统计学意义。经典途径及凝集素途径的共同标志物 C4d 三组间两两比较均有显著差异（P ＜ 0.05），初发病例组和斑块组水平均高于正常组；经典激活途径产物 C1q 水平在三组之间依次升高，但正常组和斑块组相比无明显统计学差异（P ＞ 0.05）；终末产物 SC5b-9 水平在正常组、斑块组和初发病例组之间依次增高，但斑块组和正常组相比无明显统计学差异（P ＞ 0.05）。

表1 3 组实验对象的一般资料及临床病理数据资料

表2 3 组间补体因子的浓度及统计学差异

表3 初发病例组补体因子与临床生化指标的相关性

2.3 补体因子与临床指标的相关性及补体间相关性分析

分析初发病例组血清补体因子水平与危险因素指标如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸等的相关性，结果见表 3。补体 C4 与葡萄糖呈明显正相关（r = 0.321，P = 0.020），其余补体分子与临床指标无明显的相关性。而补体之间的相关性分析表明，C1q、C4d 水平与 SC5b-9 水平呈明显正相关（r = 0.439，P = 0.001；r = 0.316，P = 0.023）（表 4）。

表4 血液补体因子之间的相关性

2.4 部分补体因子水平的变化趋势

动态监测组患者发病 6 h 血清中 C1q、C4d 的水平与正常组相比无明显差异，12 h 开始增长，24 h 时达到最高，到第 7 天降至正常水平；而终末产物 SC5b-9 的水平有所差异，在发病 6 ～ 72 h 呈现逐渐升高的趋势，第 5 天达到最高，第 7 天下降至正常水平（表 5）。

3 讨论

越来越多的证据表明炎症在卒中（尤其是缺血性卒中）的发病机制中起重要作用[3-4]。而补体作为炎症反应的主要组成部分，在脑梗死中的作用日益引起重视。大量的动物实验表明，卒中后的脑组织中有各种补体级联成分的沉积[5-6]。而补体系统的过度活化是造成脑内炎症损伤的重要因素[7-8]。以往的研究认为，大动脉粥样硬化性及隐源性脑卒中患者急性期血浆补体 C3 水平持续升高[9]，本实验在此基础上选取不同激活途径的补体分子来更好地阐明补体激活在脑梗死中所起的作用。

表 5 动态监测组与正常组血清中补体含量比较（±s ）

表 5 动态监测组与正常组血清中补体含量比较（±s ）

C 1 q C 4 d S C 5 b -9动态监测组6 h 1 7 1 . 1 6 ± 1 2 . 6 5 1 7 . 9 4 ± 2 . 8 1 3 3 6 . 5 0 ± 4 8 . 5 8 1 2 h 2 0 0 . 4 0 ± 2 2 . 4 6 2 3 . 4 0 ± 4 . 1 6 3 4 8 . 3 6 ± 5 3 . 9 0 2 4 h 2 5 6 . 5 3 ± 2 7 . 9 1 2 8 . 9 8 ± 4 . 6 1 3 5 5 . 5 6 ± 5 8 . 2 2 3 6 h 2 2 7 . 7 8 ± 2 3 . 0 1 2 5 . 6 0 ± 4 . 7 1 3 6 7 . 6 5 ± 6 0 . 5 5 7 2 h 2 0 1 . 4 0 ± 1 1 . 4 2 2 3 . 3 8 ± 3 . 9 7 3 8 0 . 1 9 ± 6 5 . 4 6 5 d 1 8 4 . 3 7 ± 1 0 . 7 8 2 1 . 0 2 ± 3 . 2 3 4 2 1 . 6 2 ± 7 3 . 6 9 7 d 1 7 1 . 6 3 ± 9 . 0 0 1 8 . 7 2 ± 2 . 2 2 3 8 5 . 2 8 ± 6 6 . 1 8正常组 1 6 4 . 7 9 ± 2 2 . 3 5 1 5 . 5 9 ± 2 . 0 5 3 3 0 . 8 9 ± 4 7 . 8 2 P ＜ 0 . 0 5 ＜ 0 . 0 0 1 ＜ 0 . 0 0 1

研究结果发现，脑梗死患者血清中补体 C1q、C4d、SC5b-9 的含量较斑块组和正常组升高，且斑块组高于正常组，说明补体激活发生在脑梗死的早期，即斑块形成时。随着病情进展，活化程度逐渐增强。而 SC5b-9 作为补体活化的终末产物，其含量的升高则预示着补体级联反应的完全活化。

经典激活途径由补体 C1 沉积于靶细胞表面而发起。C1 是由 C1q、C1r 和 C1s 组成的三蛋白复合物。C1q 作为其中最大的蛋白，除了参与 C3-转化酶的形成，还有其自身的特异性受体和细胞功能，即 C1q 的细胞沉积可通过补体级联依赖与独立机制导致组织损伤[10]。Rossen 等[11]证实细胞完整性的丢失导致大量的亚细胞成分暴露于细胞外环境，吸引 C1q，导致下游补体效应分子的激活。Mack 等[12]证实，C1q 在脑缺血发生后 3 ～ 6 h 之间开始在小鼠脑中沉积。我们的结果显示，血清补体 C1q 在 6 h 开始上升，在24 h 达到峰值，然后逐渐降低到正常水平，因此可以看出脑组织和血液中补体的沉积时间有所差异，这可能是由于各种脑细胞，包括神经元和神经胶质，可以产生补体成分[13]。

补体 C3 和 C4 是急性期蛋白，是免疫系统的补体通路的重要组成成分[14-15]。C3 的活化在局灶性脑缺血性卒中的补体相关炎性损伤中起关键作用[16]。在缺血性卒中中，补体的激活主要由 C3 途径发起，因为替代途径用于放大由经典和（或）凝集素途径引发的补体激活，从而导致组织损伤[17]。而我们的结果显示，脑梗死患者血清中补体 C3 和C4 的水平与斑块组和正常组无明显差异，这可能是因为入组的患者已进入亚急性期或慢性期，很多急性期蛋白已经消耗殆尽。

补体 C4d 是补体 C4 的裂解片段，仅存在于补体激活的经典途径和凝集素途径中，能与周围的内皮细胞共价结合，是比较稳定的组分，可结合于血小板的表面，影响血小板的聚集及血小板与循环的白细胞和内皮细胞之间的相互作用[18]，可以促进黏附分子如 E-选择素和 P-选择素的上调，从而促进内皮细胞的激活[19-20]。赵军等[21]通过动物实验发现，在脑缺血再灌注 6 h 组开始检测到 C4d，24 h 组最高，再灌注 48 h 组 C4d 的沉积明显减少。与我们的血清中补体含量的变化趋势基本吻合，证实了脑梗死中补体经典途径和凝集素途径的参与。

作为补体激活途径的最终产物，SC5b-9 可沉积于细胞膜，使细胞分泌 P-选择素、血小板活化因子等引起细胞水肿，破坏血脑屏障，同时激活单核细胞，释放氧自由基等毒性物质，加剧炎症反应，或者直接插入细胞中，导致细胞溶解死亡。以往的研究显示，在发病 1 d 以内 SC5b-9 并没有显著升高，48 h 以后才出现显著升高，一直持续到 10 d以后[22]。而我们的结果显示，其在发病 6 ～ 72 h 呈现逐渐升高的趋势，第 5 天达到最高，第 7 天下降至正常水平。这表明个体间补体激活程度的差异，考虑与患者入院后药物的使用及患者自身免疫系统的差异相关。

补体因子与临床指标的相关性分析显示，补体激活与临床指标无明显的相关性，这可能归因于脑梗死的各种危险因素如高血糖、高血脂等多种因素的共同作用而导致血管病变，而补体的激活进一步加重血管病变，从而促使脑梗死的发生。

本研究证实了脑梗死患者中补体系统的活化，补体系统在缺血性脑损伤中起关键作用。补体的经典途径和凝集素途径参与了脑梗死的病情进展，然而替代途径是否参与脑梗死的发生，尚需扩大样本进一步证实。针对补体激活的干预将为脑梗死的治疗提供更加广阔的前景。

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国家干细胞临床研究专家委员会第三次会议在京召开

按照 2016 年 12 月 15 日国家干细胞临床研究专家委员会（以下简称专家委员会）第二次会议精神，我会作为专家委员会秘书处根据专家委员会的审核意见通知各申报机构，建议其修改、补充、完善备案材料，并对补充后的备案材料进行了形式复审。

2017 年1 月9 日专家委员会主任委员曹雪涛院士在北京主持召开了专家委员会第三次会议，19 位专家委员会成员出席了本次会议。本次会议对干细胞临床研究项目补充后的备案材料进行了复审。

国家卫生计生委科教司张黎明副巡视员出席会议并讲话，国家卫生计生委科教司王锦倩处长，国家食药监总局药化注册司常卫红处长，中国医药生物技术协会吴朝晖秘书长出席会议。

中国医药生物技术协会第五届第三次理事会顺利召开

按照协会章程和民政部的有关规定，为了总结协会 2016 年工作，做好 2017 年的工作安排，协会第五届第三次理事会于 2016 年12 月24 日在杭州召开，会议由李少丽副理事长主持。会议审议通过了协会2016 年工作报告和财务报告、中国医药生物技术协会 3D 打印技术分会设立申请、协会行业信用评价工作方案、协会团体标准管理办法（试行）和标准工作专家委员会管理办法（试行）；审定通过了新申请入会 44 家单位名单，同意增补贵州百灵企业集团制药股份有限公司为常务理事单位，同意增补北昊干细胞与再生医学研究院有限公司等 7 家为理事单位。会议还听取了到会理事对协会工作的意见和建议。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.015

国家高技术研究发展计划（863 计划）（2011AA02A103）

100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院/北京市免疫试剂临床工程技术研究中心

康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

2016-10-21