栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注大鼠肢体功能及GAP-43的影响

韩 静 张继州 钟志凤 胡 娟,2*

1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

实验研究

栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注大鼠肢体功能及GAP-43的影响

韩 静1张继州1钟志凤1胡 娟1,2*

1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

目的：探讨栝楼桂枝汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后肢体运动功能以及生长相关蛋白-43的作用。方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组和栝楼桂枝汤组各7只，线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型，栝楼桂枝汤组于造模后给予栝楼桂枝汤治疗，每日1次，连续14d。分别于造模后1d、3d、7d和14d采用改良神经功能缺损评分(mNSS)、平衡木平衡试验(BeamBalance)、足失误试验评价神经功能恢复状况；采用免疫荧光组织化学方法检测脑缺血周边区GAP-43的表达。结果：栝楼桂枝汤可显著降低脑缺血损伤大鼠的mNSS评分、降低BeamBalance评分，减小足失误比率(P<0.05)。栝楼桂枝汤组GAP43阳性细胞数较模型组显著升高(P<0.05)。结论：栝楼桂枝汤可促进脑缺血损伤大鼠肢体功能的恢复，该活性可能与其增加脑组织GAP-43蛋白的表达相关。

栝楼桂枝汤；脑缺血；肢体功能；GAP-43

缺血性脑卒中以高发病率、高致残率、高复发率己成为严重威胁人类生命与健康的主要疾病之一，超过三分之二的缺血性脑卒中患者遗留有不同程度的后遗症，严重影响生活质量[1]。目前，针对缺血性脑卒中后遗症尚无有效治疗药物，因此，研发可改善因脑缺血损伤所致的肢体障碍的药物具有重要的临床意义与应用前景。

栝楼桂枝汤出自张仲景《金匮要略》，用于治疗太阳病引起的痉挛及内伤杂病中出现的抽搐、发痉、手足蠕动等，福建中医药大学康复医院在临床实践中将该方运用于治疗脑卒中后肢体痉挛，重用栝楼根，取其清热生津、柔润筋脉之效，取得了显著的疗效[2-3]。本研究在大鼠脑缺血再灌注模型上观察栝楼桂枝汤对大鼠肢体功能障碍的作用，并通过观察该方对脑组织生长相关蛋白-43(Growth Associated Protein-43，GAP-43)表达的作用探讨栝楼桂枝汤治疗脑缺血的作用机制。

1 动物与材料

1.1 动物 SD大鼠，雄性，280～300g，共21只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号SCXK(沪)2015-0002)，光暗周期12/12 h(光照时间8:00～20:00)下饲养，自由饮食。

1.2 材料 中药饮片天花粉(批号：16031)、桂枝(批号：160402)、芍药、甘草(批号：160401)、大枣(批号：160401)购自福建中医药大学附属国医堂。兔抗GAP-43抗体(批号：ab16053，Abcam公司)，免疫荧光封闭液、抗荧光淬灭封片剂等购自碧云天生物技术公司，其余试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型 采用线栓法制作大脑中动脉闭塞/再灌注模型[4]。10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉动物，钝性分离右侧颈总动脉(Common Carotidartery, CCA)、颈外动脉(External Carotidartery, ECA)和颈内动脉(Internal Carotid Artery, ICA)，分别电凝ECA分支枕动脉和甲状腺上动脉。在距CCA分叉大约1cm处结扎ECA近心端，电凝远心端。夹闭CCA，在ECA残端距CCA分叉3mm处剪一小口，将MCAO线栓经ECA插入ICA，线栓头端距CCA分叉处约18mm，此时进线有轻微阻力，栓线正好插至颅内的大脑前动脉，堵住大脑中动脉(MCA)开口，制成MCAO模型。造模后2h，以半剂量10%水合氯醛再次麻醉动物，拔出线栓，结扎ECA残端。术后20～25℃条件下饲养大鼠，自由进食水。假手术组除不在颈内动脉插入线栓外，其余步骤与上述相同。

模型制作后按Longa神经功能缺失5分制评分标准[5]进行神经功能评分，评1～3分者为模型成功纳入标准。评分标准：0分：无明显神经缺损症状，活动正常；1分：提尾悬空时不能完全伸展左侧前爪；2分：行走时身体向偏瘫的左侧转圈，即追尾征；3分：行走时向偏瘫的左侧倾倒；4分：不能自发行走或清醒障碍。

2.2 中药煎煮方法及动物分组给药 栝楼桂枝汤煎剂由天花粉30g，桂枝9g，芍药15g，甘草6g，生姜9g，大枣12 枚组成。按药典方法进行显微鉴定和指标性成分含量测定，符合药典标准方可使用。中药饮片放入电药锅加入去离子水，以水面超过药物3～5cm为宜，浸泡40min后煎煮；先用武火烧开，再用文火煎熬20min；煎煮2次，合并2次煎液浓缩。根据动物体表面积等效剂量表计算，大鼠的灌胃剂量为生药量5g/kg体重。

SD大鼠随机分为假手术组、模型组和栝楼桂枝汤组，每组7只，按上述方法造模，栝楼桂枝汤组于再灌注后即刻灌胃给予栝楼桂枝汤，每日1次，连续给药14d，模型组和假手术组灌胃给予等体积生理盐水。

2.3 动物神经行为学评价于大鼠脑缺血再灌注后第1天、3天、7天、14天4个时间点，采用mNSS评分、平衡木平衡试验和足失误试验，对动物神经行为学表现进行评分。

2.3.1 mNSS评分 参照文献[6]进行改良神经损伤严重程度评分法(Modified Neurological Severity Score，mNSS)，mNSS评分包含了对运动、感觉、反射及平衡的全面评价，最低分0分,最高分14分。0分为神经功能正常；1～5分为神经功能轻度损害；6～9分为神经功能中度损害；10～14分为神经功能重度损害。

2.3.2 平衡木平衡试验 平衡木平衡试验评价动物肢体的协调和平衡能力，动物放置在1根宽1.5cm，长30cm，高于地面30cm的木条[6]上，观察动物在其上的行为表现，评分为0～6分。0分：保持平衡稳定状态；1分：抓紧平衡木边缘；2分：抓紧平衡木并1只脚从平衡木落下；3分：抓紧平衡木，并且2只脚从平衡木上落下，或在平衡木旋转(>60s)；4分：试图在平衡木上保持平衡，但落下(>40s)；5分：试图在平衡木上保持平衡，但落下(>20s)；6分：落下：没有试图保持平衡或抓住平衡木(<20s)。得分越高神经损伤越严重。

2.3.3 足失误试验 足失误试验[7]是评价动物前肢定位功能的行为学实验，实验动物被放置在1个45 cm×30 cm，高于地面2.5cm的网格平板上，网格的尺寸是2.5 cm×2.5 cm，生理情况下，动物在网格上行进时会将它们的爪子放在网格线的交叉处，当病理条件下，动物无法正确放置它们的爪子，前肢会掉落在网格中。当爪子掉落或滑落在网格线之间，被记录为1次足失误，记录3min内，双侧前肢行走步数及其中左侧前肢的足失误次数，以足失误次数占总的前肢行走步数的百分比表示足失误评分。

2.4 免疫荧光化学染色及图像分析 最后一次行为学评价结束后，各组取5只动物，10%水合氯醛麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛，取脑，经20%、30%蔗糖梯度脱水后，制作30μm冠状冰冻切片。采用漂片法进行GAP-43免疫荧光染色，切片经0.01MPBS洗涤后，在山羊血清中室温封闭1h，然后抗GAP-43抗体(1：400)中4℃孵育过夜，随后在荧光标记二抗中37℃避光孵育1h。最后将切片裱于玻片，用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜400倍镜下观察并拍照，各组每例动物均拍摄2张脑片，每张切片拍摄5个不重叠的随机视野，计数各视野的平均阳性细胞数。

3 结果

3.1 栝楼桂枝汤改善脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分 大鼠脑缺血再灌注后，神经功能减弱，mNSS评分显著增加(P<0.01)，给予栝楼桂枝汤，于脑缺血再灌注后1d起即可显著降低mNSS评分(P<0.05)，改善神经行为学功能(见表1)。平衡木测试和足失误测试是评价动物平衡和肢体协调能力的测试，结果见表2、3，栝楼桂枝汤组动物在各个时间点的BeamBalance评分均低于模型组(P<0.05)，脑缺血再灌注后1d、3d和7d，栝楼桂枝汤组动物足失误的比率低于模型组(P<0.05)，表明栝楼桂枝汤可改善脑缺血动物肢体平衡力和肢体的协调性。

表1 栝楼桂枝汤对mNSS评分的影响 (分

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，#P<0.01。

表2 栝楼桂枝汤对Beam Balance评分的影响 (分

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，#P<0.01。

表3 栝楼桂枝汤对足失误评分的影响 (分

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，#P<0.01。

3.2 栝楼桂枝汤对脑缺血周边脑皮质GAP-43表达的影响 免疫荧光组织化学染色结果显示，GAP-43阳性标记主要分布于神经细胞胞体和突起的胞质中，假手术组仅有少量GAP-43阳性染色分布。模型组GAP-43阳性细胞数显著多于假手术组(P<0.01)，而给予栝楼桂枝汤治疗可增加GAP-43的免疫荧光强度，阳性细胞数显著增加(P<0.05)。

组别例数GAP-43阳性细胞数假手术组520.86±3.88模型组5 41.34±11.06#栝楼桂枝汤组5 56.6±7.79*

注：与模型组比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.01。

4 讨论

研究采用mNSS、平衡木平衡、足失误试验等多种神经行为学评价手段，观察了栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注大鼠神经行为和肢体障碍康复的作用，结果显示栝楼桂枝汤可显著改善脑缺血所致的神经行为功能障碍，改善动物平衡力和肢体协调性，表明了栝楼桂枝汤对脑缺血损伤具有神经保护作用。

GAP-43是神经组织特异性磷酸蛋白，分布于神经元、再生的雪旺细胞和神经胶质细胞，对于神经系统发育过程的轴突生长和突触形成具有重要的促进作用，被认为是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物[8]。研究显示[9]，在脑缺血损伤时，GAP-43的表达增高与内源性神经再生相关。本研究显示，大鼠脑缺血再灌注损伤14d后，脑组织缺血周边皮质GAP-43的表达显著高于假手术组，给予栝楼桂枝汤后观察到，大鼠脑缺血周边区脑皮质GAP-43的表达显著升高，这一结果表明栝楼桂枝汤可促进脑缺血损伤后的轴突生长发育和突触可塑性，这可能是栝楼桂枝汤改善脑缺血后肢体功能障碍的机制之一。

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(编辑：梁志庆)

2016-11-09

福建省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1035-14)。

韩静(1980-)，女，博士，副研究员，研究方向为中药药理学。E-mail：smilinghj@163.com

胡娟(196-)，女，汉族，硕士，教授，研究方向为中药物质基础。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R285

A

1007-8517(2017)02-0044-03