全反式维甲酸对高糖诱导的HK-2细胞外基质合成的影响及可能机制

黄 翀 陈艳霞 秦晓华 邹宏昌 徐承云 徐高四 房向东 涂卫平

(南昌大学第二附属医院肾内科，江西 南昌 330006)

全反式维甲酸对高糖诱导的HK-2细胞外基质合成的影响及可能机制

黄 翀 陈艳霞 秦晓华 邹宏昌 徐承云 徐高四 房向东 涂卫平

(南昌大学第二附属医院肾内科，江西 南昌 330006)

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对高糖诱导HK-2细胞外基质合成的影响及其在延缓糖尿病肾病肾间质纤维化中的可能作用机制。方法 将体外培养的HK-2细胞随机分为七组：A组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B组(30 mmol/L D-葡萄糖)、C组(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D组(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E组(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F组(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G组(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖)，各组细胞均培养48 h。应用ELISA 法检测细胞培养液结缔组织生长因子(CTGF)和Ⅳ型胶原的表达水平；RT-PCR法检测细胞RhoA、ROCK1的表达水平。结果 B组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA 的表达较A组显著升高(P<0.05)，D、E、F组RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 较B组均表达减少(P<0.05)，且随着ATRA浓度的升高呈现剂量依赖性。G组RhoA mRNA的表达与B组无明显差异，但ROCK1 mRNA 的表达较B组显著减少(P<0.05)；直线相关分析显示高糖组，D、E、F组RhoA mRNA 与ROCK1 mRNA 表达呈正相关(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)；ELISA 结果显示D、E、F组及G组CTGF、Ⅳ型胶原表达较B组显著下降(P<0.05)，且下降程度与ATRA浓度呈现剂量相关性。结论 ATRA在一定浓度范围内可抑制高糖诱导的HK-2细胞外基质的合成，延缓肾间质纤维化，其机制可能与抑制RhoA/ROCK通路有关。

高糖；全反式维甲酸；RhoA/ROCK信号通路；HK-2细胞

肾间质纤维化(RIF)是各种慢性肾脏病(CKD)发展的最终病理结果。肌成纤维细胞(MF)的产生与活化引起细胞外基质的过多沉积被认为是RIF发生的主要机制。MF主要通过肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)而来，而纤维连接蛋白(FN)、肺纤维化结缔组织生长因子(CTGF)和Ⅳ型胶原等均是EMT形成的重要生物标记物。近些年研究报道，转化生长因子(TGF)β/smad信号通路可通过促进EMT的形成触发RIF的发生，且RhoA/ROCK信号通路与TGFβ/smad信号通路在此过程中具有平行作用〔1〕。最近研究表明全反式维甲酸(ATRA)可抑制高糖诱导的HK-2细胞FN、层黏连蛋白(LN)的合成而延缓糖尿病肾病(DN)肾脏纤维化的发生〔2〕。然而，目前ATRA可否通过Rho/ROCK信号通路影响高糖诱导的RIF的报道甚少。本文拟探讨ATRA对CKD保护性生物学效应的相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 HK-2细胞株(ATCC细胞库)；ATRA、Rho 激酶抑制剂Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；酶标仪(美国 Thermo公司)，RNA逆转录试剂盒(日本Takara公司)，ELISA试剂盒(武汉优尔生商贸有限公司)。

1.2 细胞培养及实验分组 用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养HK-2 细胞株，在适宜环境下(37℃、5%CO2)待细胞生长至约70%～ 80%融合后接种入6孔培养板中继续培养，待至80% 融合后用无血清DMEM/F12同步生长48 h。随机将细胞分为七个实验组：A组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B组(30 mmol/L D-葡萄糖)、C组(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D组(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E组(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F组(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G组(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖且Y-27632提前30 min 加入)，各组细胞均培养48 h。每次实验均重复3 次。

1.3 ELISA法定量检测蛋白表达水平 收集干预48 h后的细胞培养上清液，按ELISA 试剂盒操作说明进行稀释、加样，读取波长为450 nm时的OD值，用EXCEL绘制标准曲线，根据标准曲线方程求出各样品CTGF和Ⅳ型胶原表达浓度。

1.4 RT-PCR检测 由美国 Invitrogen公司设计合成RhoA、ROCK1、β-actin引物各一对，序列见表1。反应条件:94℃预变性5 min，55℃退火30 s，72℃延伸7 min，共35个循环。配制2%琼脂糖凝胶，PCR 产物电泳仪内90 V，30 min完成电泳后在凝胶成像系统成像并使用Quantity One软件进行数据分析。

表1 引物序列

基因引物序列产物(bp)RhoA正义5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'356反义5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3'ROCK1正义5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3'293反义5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3'β-actin正义5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'434反义5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件行单因素方差分析，t检验；相关性分析采用Pearson直线相关分析。

2 结 果

2.1 高糖和ATRA对RhoA、ROCK1 mRNA表达的影响 B组RhoA及ROCK1 mRNA的表达均较A组明显升高(P<0.05)，D、E、F组RhoA及ROCK1 mRNA 均较B组的表达显著减少(P<0.05)，且与ATRA浓度呈现一定的剂量依赖性。G组RhoA mRNA的表达与B组无明显差异，但ROCK1 mRNA 的表达较B组显著减少(P<0.05)。见表1，图1。

2.2 相关性分析 直线相关分析显示B、D、E、F组RhoA mRNA 与ROCK1 mRNA 表达呈正相关(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)。

2.3 高糖和ATRA对CTGF、Ⅳ型胶原表达的影响 D、E、F组及G组CTGF、Ⅳ型胶原表达较高糖组均显著下降(P<0.05)，且下降程度与ATRA浓度相关。见表2。

组别RhoAmRNAROCK1mRNAA组0.249±0.0070.356±0.009B组0.548±0.0191)0.936±0.0111)C组0.248±0.0020.352±0.011D组0.482±0.0121)2)0.687±0.0091)2)E组0.392±0.0101)2)3)0.384±0.0091)2)3)F组0.276±0.0121)2)3)4)0.257±0.0101)2)3)4)G组0.553±0.0171)0.143±0.0122)

与A组比较:1)P<0.05；与B组比较:2)P<0.05；与D组比较:3)P<0.05；与E组比较:4)P<0.05；下表同

图1 各组RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 的表达水平

组别CTGF(ng/ml)Ⅳ型胶原(ng/ml)A组64.656±2.18247.520±0.922B组692.930±6.8961)383.203±8.1231)C组67.056±2.54547.370±0.356D组375.896±6.4381)2)313.883±8.3861)2)E组204.900±5.1181)2)3)226.276±1.5571)2)3)F组134.906±4.7471)2)3)4)151.78±0.6621)2)3)4)G组235.310±5.8891)2)81.893±0.6601)2)

3 讨 论

DN是糖尿病全身微血管病变之一，是糖尿病常见的严重并发症之一，也是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。既往研究报道，肾小球病变是DN发生的主要原因，而近年发现肾小管病变和肾间质纤维化与DN的预后有着更为密切的关系，且国内外研究表明高糖可诱导EMT的发生，最终道导致RIF的形成〔3,4〕。EMT的发生涉及多个细胞内信号转导途径，TGFβ/smad是在介导EMT时被研究较为广泛的信号通路之一。近年有研究认为〔1〕，EMT过程涉及的众多的信号通路中，RhoA/ROCK与TGFβ/smad是两条重要且平行的信号通路。Raquel等〔5～7〕通过使用RhoA/ROCK特异性阻断剂证实RhoA/ROCK在血管紧张素Ⅱ导致的EMT中起关键作用，其机制可能与Rho激酶抑制剂阻断了肾脏细胞外基质合成有关。本实验发现高糖可通过RhoA/ROCK通路诱导Ⅳ型胶原的合成，使HK-2细胞外基质累积，进而引起肾小管间质纤维化。而使用Rho激酶抑制剂后，Ⅳ型胶原的表达较高糖诱导组显著减少，这意味着RhoA/ROCK通路在高糖诱导的肾间质纤维化中起重要作用。

ATRA是维生素在体内的天然活性衍生物，在细胞分化和维持内环境方面发挥着广泛的效应。ATRA是一组核受体家族的配体，通过激活维甲酸受体(RAR)和维甲酸X受体(RXR)，调控机体多种基因的表达，完成多种生物学效应〔8〕。近年来ATRA在RIF形成机制的研究中成为热点，Zhou等〔9〕研究发现ATRA能延缓单侧输尿管梗阻大鼠的肾间质纤维化，进一步的研究表明低表达的RARα/RARβ与大鼠RIF进展中的细胞外基质的积聚相关，这些均提示RARα/RARβ可成为预防肾间质纤维化新的治疗靶点〔10〕。有学者通过ATRA作用于糖尿病大鼠模型时发现，ATRA可缓解糖尿病大鼠早期肾脏损伤,并减少细胞外胶原基质的过度累积,最终延缓肾脏纤维化〔11〕。本研究提示ATRA参与缓解高糖刺激下的肾小管间质纤维化；同时，Person相关分析结果推测ATRA的保护作用与RhoA/ROCK通路有关。本实验显示给予高糖刺激后RhoA mRNA 和ROCK1 mRNA表达增强，加入ATRA干预后，其表达随ATRA浓度的增加而逐渐减弱。ATRA通过RhoA/ROCK通路发挥保护作用的具体机制有待进一步研究。

1 Das S,Becker BN,Hoffmann FM,etal.Complete reversal of epithelial to mesenchymal transition requires inhibition of both ZEB expression and the Rho pathway〔J〕.BMC Cell Biol,2009;10(1):94.

2 孟 雪,郭汉城,关天俊.全反式维甲酸对高糖诱导HK-2细胞FN、LN表达的影响〔J〕.临床医学工程,2011;18(7):992-4.

3 Lee YJ,Han HJ.Troglitazone ameliorates high glucose-induced EMT and dysfunction of SGLTs through PI3K/Akt,GSK-3β,Snail1,and β-catenin in renal proximal tubule cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;298(5):F1263-75.

4 Alisson-Silva F,Freire-de-Lima L,Donadio JL,etal.Increase of O-glycosylated oncofetal fibronectin in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human epithelial cells〔J〕.PLoS One,2013;8(4):e60471.

5 Raquel RD,Carrajal-Gonzalez G,Samchez-Lopez E,etal.Pharmacological modulation of epithelial mesenchymal transition caused by angiotensinⅡ.Role of ROCK and MAPK pathways〔J〕.Pharm Res,2008;25(10):2447-61.

6 Zuehlke J,Ebenau A,Krueger B,etal.Vectorial secretion of CTGF as a cell-type specific response to LPA and TGF-β in human tubular epithelial cells〔J〕.Cell Commun Signal,2012;10(1):25.

7 Kroening S,Neubauer E,Wullich B,etal.Characterization of connective tissue growth factor expression in primary cultures of human tubular epithelial cells:modulation by hypoxia〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;298(3):796-806.

8 Xu Q,Lucia-Cazana J,Kitamura M,etal.Retinoids in nephrology:promises and pitfalls〔J〕.Kidney Int,2004；66(6):2119-31.

9 Zhou TB,Qin YH,Li ZY,etal.All-transretinoic acid treatment is associated with prohibitin expression in renal interstitial fibrosis rats〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(3):2769-82.

10 Long YB,Qin YH,Zhou TB,etal.Association of retinoic acid receptors with extracellular matrix accumulation in rats with renal interstitial fibrosis disease〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(11):14073-85.

11 姚春萌,郭汉城,黄清河,等.全反式维甲酸延缓糖尿病肾脏纤维化进展的实验研究〔J〕.中国中西医结合肾病杂志,2009;10(2):124-6.

〔2015-12-30修回〕

(编辑 袁左鸣)

江西省卫生厅科技计划(20151BBG70173)

涂卫平(1960-)，男，主任医师，主要从事肾间质纤维化研究。

黄 翀(1985-)，女，主治医师，主要从事慢性肾脏病防治研究。

R587.2；R965

A

1005-9202(2017)01-0038-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.016