丹皮酚对大鼠急性心肌梗死后核因子-κB p65通路的影响

赵静怡 张树峰 姚银辉 顾媛媛 时昭平 周晓慧

(承德医学院,河北 承德 067000)

丹皮酚对大鼠急性心肌梗死后核因子-κB p65通路的影响

赵静怡 张树峰 姚银辉1顾媛媛 时昭平 周晓慧

(承德医学院,河北 承德 067000)

目的 探讨丹皮酚对大鼠急性心肌梗死后(AMI)心肌组织核因子(NF)-κB p65通路的影响。 方法 大鼠结扎左冠状动脉前降支建立AMI模型，分为模型组和丹皮酚低、中、高剂量组4、6、8 mg·kg-1·d-1及卡托普利组10 mg·kg-1·d-1；另设假手术组只穿线不结扎。连续给药4 w后处死大鼠，Masson染色法分析心肌组织胶原沉积变化；免疫组化法检测p-IκB及 NF-κB p65蛋白的表达。 结果 4、6、8 mg·kg-1·d-1丹皮酚给药4 w后,大鼠心肌组织的胶原沉积量较模型组显著减少。丹皮酚还可下调心肌组织中NF-κB p65、p-IκB的蛋白表达。 结论 丹皮酚对大鼠AMI后心室重构有明显的治疗和改善作用,抑制NF-κB p65的表达和活化是其作用机制之一。

丹皮酚；急性心肌梗死；核因子-κB p65

心肌缺血后氧自由基生成过多和(或)抗氧化能力减弱均会导致体内氧化应激反应的发生，尤其是活化的核因子(NF)-κB由细胞质进入细胞核启动相关炎症因子的大量表达是导致室壁增厚及胶原过度沉积出现严重病理改变的重要因素〔1〕。现代药理学研究丹皮酚具抗心律失常、改善血管内皮功能、抑制心肌间质纤维化〔2〕，对心肌有良好的保护作用及抗炎作用〔3〕。本实验以急性心肌梗死(AMI)大鼠为模型，观察丹皮酚对AMI大鼠心肌组织NF-κB p65/IκB蛋白表达的影响，探讨丹皮酚改善心室重构作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂 健康雄性Wistar大鼠，体重280～300 g，北京华阜康生物科技有限公司(批号：SCXK京2009-0004 0245860)；丹皮酚注射液(宁波天真制药有限公司/批号：20110603/规格：10 mg)，卡托普利(江苏平光制药有限公司/批号：120102/规格：25 mg)；兔抗NF-κB p65抗体、鼠抗p-IκB抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；免、鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；病理特殊染色液套盒(Masson染色专用)珠海贝索生物技术有限公司； RIPA裂解液，上海贝博生物；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 主要仪器 ECG-11D心电图机，惠州科美思医用仪器有限公司；小动物人工呼吸机淮北正华生物科技有限公司；酶标仪，MK-3，芬兰Thermo公司；冷冻离心机，德国 Kendro Labrotary公司；SIM-F124 制冰机，日本SANYO 公司； STP120自动组织处理机、171型组织自动包埋机，美国Thermo Electron Corporation；TK-218型恒温摊片烤片机，湖北泰维医疗科技有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立与分组 健康雄性Wistar大鼠70只在实验室喂养1 w，适应环境。然后随机抽取10只制作假手术组，其余60只大鼠8%水合氯醛腹腔注射麻醉，经气管插管连接呼吸机，左侧腋下三、四肋间逐层开胸，于左心耳下缘2 mm处使用无菌线完全结扎左冠状动脉前降支，然后立即逐层关胸并缝合。观察大鼠心电图ST段的变化，以ST段持续抬高并出现室性心律失常作为判断AMI模型成功的标准。术后3 d将成模大鼠随机分为5组：模型组(n=9)、丹皮酚低剂量组(n=8，4 mg·kg-1·d-1)、丹皮酚中剂量组(n=8，6 mg·kg-1·d-1)、丹皮酚高剂量组(n=8，8 mg·kg-1·d-1)、卡托普利组(n=8，10 mg·kg-1·d-1)；同时假手术组(n=8)在相同部位只穿线不结扎。丹皮酚用药组每天经腹腔注射1次，卡托普利经灌胃给药，假手术组和模型组大鼠每天以等量生理盐水灌胃，按等效体表面积计算同阳性药给药体积，每周根据体重变化调整剂量，各组大鼠给药时间均为4 w。

1.3.2 组织标本采集与处理 给药4 w，脱椎处死大鼠，结扎线下切取3～5 mm心肌组织， 10%甲醛固定，24 h后常规石蜡包埋，5 μm连续切片，Masson染色观察心肌胶原沉积情况。同时切左心室取非梗死部位，用无菌锡箔纸包裹后迅速放于液氮罐中冷冻，24 h 后放于-80℃冰箱保存，用以免疫组化检测相关指标。

1.3.3 Masson染色观察心肌胶原沉积情况 各组大鼠心肌组织5 μm连续切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇洗涤蒸馏后组织切片固定与Bouin液中过夜。其余按照试剂盒说明进行操作。

1.3.4 免疫组化法检测肝组织NF-κB p65及IκB的蛋白表达情况 取大鼠心肌组织，4%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片后二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%H2O2-甲醇消除过氧化物， 0.01 mol/L(pH6.0)柠檬酸缓冲液微波修复；10%山羊血清封闭；NF-κB p65及p-IκB一抗(1∶100及1∶50稀释)，4℃孵育过夜；37℃复温30 min，滴加生物素标记二抗；滴加HRP标记链亲和素；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性胶封片，镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗。 结果判定：NF-κB以细胞质及细胞核中出现淡黄至褐黄色颗粒状着色者为阳性表达；p-IκB以细胞质出现淡黄至褐黄色颗粒状着色者为阳性表达。IPP6.0测量心肌组织中NF-κB p65及p-IκB免疫组化染色的IOD值，计算光密度平均值，半定量检测NF-κB p65核转移变化。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行方差分析，各组间两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 丹皮酚对AMI大鼠心肌组织胶原含量变化的影响 假手术组间质只可见散在胶原，提示心肌基本未受损；模型组间质胶原明显增多，表明心室重构确实发生；丹皮酚中、高剂量组间质胶原有不同程度的减少以红色心肌组织为主，间杂以胶原组织，也表明丹皮酚对心室重构有改善作用；丹皮酚高剂量组间质胶原的减少较卡托普利组更为明显。见图1。

2.2 丹皮酚对AMI大鼠心肌组织中NF-κB p65及IκB蛋白表达的影响 ①假手术组胞质中仅有少量的p-IκB表达；模型组中p-IκB的表达显著升高，提示心室重构发生后，IκB的活化程度增强(P<0.05)；各用药组p-IκB的表达较模型组显著降低(P<0.05)；丹皮酚高剂量组p-IκB的表达减少更为明显。见图2，表1。②假手术组胞核中略见少量的NF-κB p65表达；模型组中NF-κB p65的表达显著升高，提示IκB的活化程度增强导致NF-κB p65在胞核中表达增强(P<0.05)；丹皮酚用药组NF-κB p65的表达较假手术组升高但较模型组显著降低(P<0.05)；丹皮酚高剂量组NF-κB p65的表达减少更为明显。见图3，表1。

图1 各组大鼠心肌组织Masson染色结果(×200)

图2 丹皮酚对AMI大鼠IκB蛋白表达的影响(DAB,×400)

图3 丹皮酚对AMI大鼠NF-κB p65蛋白表达的影响(DAB，×400)

组别P-I-κBNF-κB假手术组0.7370±0.01892)0.7537±0.01952)模型组1.2569±0.03881)1.2779±0.03521)丹皮酚低剂量组1.0826±0.02441)2)1.1266±0.01931)2)丹皮酚中剂量组1.0057±0.01261)1.0126±0.01911)丹皮酚高剂量组0.8205±0.02081)0.9091±0.01831)卡托普利组0.7648±0.02171)0.8248±0.02021)

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

NF-κB是调节基因表达的关键因子之一，也是炎症反应的调节因子，几乎存在于所有细胞中。正常情况下，以二聚体形式和其抑制蛋白IκB结合以无活性状态存在于胞质中，其最常见的形式是以p65和p50或p52蛋白亚基组成的二聚体，在细胞繁殖，抑制细胞凋亡以及天然免疫等许多细胞事件中都起着重要作用。相关研究证实，NF-κB在正常血管壁及心肌组织无表达或极少量表达，而在动脉粥样斑块〔4～6〕、心肌梗死后的心肌组织以及心力衰竭的心肌组织中NF-κB活性明显增高〔7，8〕。本次实验结果显示，模型组中NF-κB的蛋白表达显著高于其他组，这与上述报道的结果一致。

AMI发生后，严重的缺血和缺氧导致大量的活性氧自由基 (ROS) 生成，而NF-κB作为一种应激反应因子，主要参与调节机体的免疫应答、调控相关炎性因子如基质金属蛋白酶(MMP)-9、肿瘤坏死因子(TNF)大量表达，导致心肌纤维的过度增生，间质胶原的过度合成，而梗死后心室重构时心肌间质明显增加,这是心室重构由代偿向失代偿乃至心力衰竭的主要原因之一〔9〕。

MMP-9是MMPs 的一种，在病理情况下，酶原被激活，能特异性地降解胞外基质，使心肌细胞外基质过度纤维化从而促使心肌发生代偿反应出现心室重构，导致心功能下降〔10〕。此外，研究还发现，动物和人 NF-κB p65 结合于MMPs 基因 527 -519 位置碱基，上调了MMP-9的表达〔1〕，从而影响MMP-9对心室重构的作用。本实验Masson染色结果显示，模型组大鼠心肌组织确实出现了大量的胶原沉积，可能是由于NF-κB的过度活化使得炎性因子大量表达，从而出现严重的病理改变。樊冬梅〔1〕实验中还报道了，AMI后机体的氧化应激反应刺激白细胞介素(IL)-1β、TNF等激活 NF-κB的诱导激酶(NIK)，促使 IκB 磷酸化降解，使得NF-κB 与IκB发生解离，被活化后由胞质转入胞核发挥调控作用。而激活的 NF-κB 又能与TNF-α、IL-6、IL-1β基因上特定靶序列相结合加强其表达，使 TNF-α、IL-1β合成增加；而自身表达增多且活化的炎症因子又进一步激活NF-κB，形成炎症反应的循环效应，导致炎症反应的持续化和扩大化，加速了心肌梗死后心室重构的发展；张军等〔11，12〕在实验中证实了NF-κB 被激活进入胞核后，通过增强TNF-α、IL-1β 以及TGF-β1 等炎性因子的表达， 从而加强对炎症反应的正反馈作用。免疫结果显示，大鼠梗死4 w后，模型组中p- IκB 及NF-κB的蛋白表达确实有显著增强，且NF-κB在胞核中有大量的表达，Masson染色中，间质胶原的大量增生均证实了炎症反应的循环效应使得心肌出现重构，心功能严重受损。

本研究表明丹皮酚对AMI后受损的心肌有明显的保护与修复作用。丹皮酚能够降低AMI后心肌组织中p-IκB的活化进而抑制NF-κB的活性，降低了相关的炎症反应，减轻了心室重构的发生。

1 樊冬梅.NF-κB在急性心肌梗死后心室重塑中的作用研究〔D〕.银川：宁夏医科大学，2010.

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3 王 显，胡大一，沙 鸥，等.复方丹皮酚滴丸对不稳定性心绞痛患者血浆炎症介质水平的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2008；28(5)：395-8.

4 沈 芳，程桂芳.IκB激酶及相关信号转导研究进展〔J〕. 生理科学进展，2001；32(1):80-2.

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9 郭张强, 廖玉华,程 翔,等.大鼠急性心肌梗死心室重塑中细胞因子与胶原的变化〔J〕.中国病理生理杂志,2006；22(12):2322-7.

10 吴志红，连晓芳，孟 岩，等.血清基质金属蛋白酶-9与慢性心力衰竭相关性分析〔J〕.疑难杂症，2009；80(3):147-8.

11 张 军，贾国良，王海昌，等.大鼠心肌梗死后心肌NF-κB、MMP-2和TIMP-2表达变化及其意义〔J〕. 心脏杂志，2006；18(1):54-9.

12 赵 元，周新民，廖晓波，等.风湿性心脏病患者致心力衰竭心肌组织中IL-1β、TGF-B1 和NF-κB p65 的表达及意义〔J〕. 心肺血管病杂志，2009；28(5):332-5.

〔2015-06-26修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省自然科学基金项目(No.C2011406009)

周晓慧(1958-)，女，教授，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究。

赵静怡(1985-)，女，硕士，主要从事心血管药理学研究。

R541

A

1005-9202(2017)01-0022-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.009

1 承德医学院附属医院药剂科