补肾健脾方对地塞米松诱导大鼠骨骼肌萎缩的影响

金晔华 徐划萍 金国琴 蒋嘉晔 龚张斌

(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203)

补肾健脾方对地塞米松诱导大鼠骨骼肌萎缩的影响

金晔华 徐划萍 金国琴 蒋嘉晔1龚张斌

(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203)

目的 探讨补肾健脾方对地塞米松诱导的骨骼肌萎缩的保护作用机制。方法 将24只SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、美雄酮组。在预设时间节点进行体质量称量，第14天测试大鼠跑台能力，第15天采用多功能生理仪检测大鼠肌张力，光镜检测肌纤维横截面；采用Western印迹方法检测骨骼肌肌球蛋白重链(Myhc)、肌肉环状指基因(MuRF)-1蛋白表达变化。结果 与正常组比较，模型组的体重、有氧运动能力、肌张力、Myhc表达显著下降，MuRF-1表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组、美雄酮组的体重、有氧运动能力、肌张力、Myhc表达显著升高，MuRF-1表达显著降低(P<0.05)。结论 补肾健脾方能有效抑制蛋白质的分解代谢，从而延缓地塞米松诱导的骨骼肌萎缩。

骨骼肌萎缩；糖皮质激素；补肾健脾；泛素化

80岁以上人群中，超过50%患有衰老性骨骼肌萎缩〔1〕，严重影响生活质量，并可诱发其他系统的衰退。研究表明，增龄性的糖皮质激素(GC)水平异常升高与骨骼肌萎缩呈正相关。骨骼肌蛋白降解增加和(或)合成减少是骨骼肌萎缩的主要原因〔2〕。泛素-蛋白酶体通路(UPS)激活可导致靶蛋白泛素化水平增高〔3〕，是GC诱导骨骼肌蛋白降解的主要机制之一。骨骼肌萎缩在中医学中归为“痿证”，病机多为脾肾亏虚，临床上应用补肾健脾法延缓肌肉萎缩常获良效〔4〕，但其具体分子机制尚待进一步研究。本研究探讨中药补肾健脾方是否能通过调控蛋白质泛素化水平从而延缓GC诱导的骨骼肌萎缩。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠24只，清洁级，体质量(300±20)g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养条件：温度18℃～22℃，光暗周期12 h∶12 h。

1.1.2 主要药物与试剂 补肾益气方：熟地黄(河南)、炙黄芪(内蒙古)、潞党参(山西)、淫羊藿(河南)、炒白术(浙江)，购自上海康桥药业有限公司。水煎2次，浓缩成剂，终浓度为2 mg生药/ml，-20℃保存。小鼠抗大鼠Myhc等购自Millipore公司，兔抗大鼠MuRF-1单克隆抗体等购自Abacm公司。

1.1.3 主要仪器 XR-PT-10A小动物跑台，上海欣软信息科技有限公司；RM6240多道生理记录仪，成都仪器厂；BIO-RAD电泳仪及转膜槽，美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 适应性饲养1 w后，采用组间比较法随机分组：①正常对照组(正常组)，②地塞米松模型组(模型组)，③模型+补肾益气组(中药组)，④模型+美雄酮组(美雄酮组)，每组6只。模型组、中药组、美雄酮组大鼠按1 mg·kg-1·d-1腹腔注射地塞米松注射液，连续14 d。正常组予生理盐水腹腔注射。

1.2.2 动物给药及称重 中药组按临床成人每公斤体质量剂量的7倍计算，进行灌胃；美雄酮组按每天1 ml/100 g剂量进行美雄酮灌胃，连续14 d。正常组及模型组予以生理盐水灌胃。分别在第1，7，11天称量各大鼠的体质量。

1.2.3 动物腓肠肌最大收缩力测试 造模结束后24 h内，4%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，连接RM6240多道生理记录仪，以强度递增刺激模式检测大鼠右下肢腓肠肌最大收缩力。

1.2.4 大鼠腓肠肌苏木素-伊红(HE)染色形态学检测及肌纤维横截面积的测量 分离大鼠左下肢腓肠肌，切取1 cm3大小的腓肠肌组织，浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蜡切片。HE染色后，采用LEICA图像采集系统选取4个视野进行拍片，放大倍数为400倍。每个视野选取20个肌纤维，应用SPOT软件计算出每个肌纤维的横截面积。

1.2.5 Western印迹法检测肌肉环状指基因(MuRF)-1、骨骼肌肌球蛋白重链(Myhc)蛋白表达 称取100 mg腓肠肌组织放入无菌Eppendorf管中，低温下超声匀浆，12 000 r/min×10 min离心取上清，以BCA法测定蛋白浓度。配8%胶，行十二烷基硫酸钠-聚乙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，蛋白转至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封闭，加一抗，4℃过夜，化学增强发光法(PBST)漂洗4次，二抗孵育，37℃摇床45 min，PBST漂洗4次。化学增强发光法(ECL)检测目标条带。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，每个样本重复6次。一抗工作浓度：抗MuRF-1及抗Myhc均为1∶2 000。Western条带应用灰度分析软件进行光密度计算。以目的蛋白/GAPDH灰度值比值作为目的蛋白的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0软件行One way anova检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠在不同检测时间点体重的变化 造模结束时，各组大鼠均未出现死亡。正常组大鼠体重稳定增加；与正常组〔(19.25±1.605)g〕比较，模型组大鼠在各检测时间点的体重明显下降(P<0.05)；与模型组比较，中药组和美雄酮组在各检测时间点的体重差异不明显(P>0.05)，也呈持续下降状态。见图1。

2.2 各组大鼠右下肢骨骼肌最大收缩力的变化 与正常组〔(19.75±1.605)g〕比较，模型组大鼠的最大收缩力〔(11.95±1.377)g〕明显降低；与模型组比较，中药组〔(18.50±2.618)g〕与美雄酮组〔(19.17±1.033)g〕大鼠肌张力显著提高(P<0.05)。

2.3 各组大鼠腓肠肌形态学检测及肌纤维横截面积的变化 模型组大鼠骨骼肌肌纤维横截面积〔(2 279±468)μm2〕明显低于正常组〔(2 895±524)μm2〕，与模型组比较，中药组〔(2 477±451)μm2〕、美雄酮组〔(2 532±510)μm2〕大鼠骨骼肌肌纤维横截面积显著增粗。见图2。

与正常组比较：1)P<0.01图1 大鼠体重变化图

图2 各组大鼠骨骼肌肌纤维横截面积(HE，×400)

2.4 各组大鼠Myhc、MuRF-1蛋白表达变化 与正常组Myhc、MuRF-1蛋白表达(0.821 6±0.112 50,0.619 2±0.081 62)比较，模型组大鼠Myhc表达(0.494 9±0.082 90)显著下降，MuRF-1(1.053 0±0.148 4)显著增高(P<0.05)；与模型组比较，中药组Myhc的表达(0.725 4±0.070 38)与美雄酮组(0.932 2±0.160 00)显著增高，MuRF-1表达显著下降(0.683 7±0.100 9，0.627 8±0.007 26，P<0.05)。见图3。

图3 Western印迹检测各组大鼠组织目的蛋白表达

3 讨 论

骨骼肌衰老是指随增龄出现的骨骼肌萎缩，体现为肌肉面积指数〔肌肉面积(kg)/身高(m2)〕降低〔5〕。在70岁以上人群中，骨骼肌萎缩程度与GC浓度的增龄性升高呈正相关。GC能通过UPS通路加速骨骼肌蛋白的降解进程，致使骨骼肌萎缩。UPS是生物体内主要的蛋白降解系统，主要包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素耦合酶(E2)、泛素蛋白连接酶(E3)、蛋白酶体和去泛素化蛋白〔6〕。MuRF-1是重要的E3家族成员，能够结合特异性的靶蛋白序列并诱导靶蛋白发生泛素化降解〔7〕。本研究采用Noh等〔8〕方法并进行改良，建立地塞米松诱导大鼠骨骼肌萎缩模型。与既往研究结果一致，本结果表明：地塞米松通过诱导MuRF-1表达增高，促使Myhc的蛋白降解增高。Myhc是收缩蛋白-肌动蛋白的生物活性区，在肌肉收缩过程中有着重要作用。Myhc过度降解产生的生物学功能体现为大鼠体重减轻，腓肠肌纤维横截面积下降，即出现骨骼肌丢失现象，最终导致骨骼肌功能衰退，肌肉最大收缩力减弱。雄性激素如睾酮(T)能部分对抗GC对骨骼肌的损伤，促进肌肉核酸及蛋白质合成代谢，这也是老年人尤其是男性在50岁之后由于T水平增龄性下降而出现骨骼肌衰老的重要原因。合理的外源性T替代疗法可有效增强肌肉功能〔9〕。但T依赖剂量、合成代谢效应并不清楚，长期使用易致前列腺癌变等副作用〔10〕，严重限制其临床应用。骨骼肌萎缩以其症状表现归为中医“痿证”。痿证由精气亏虚而起，与脾胃之气直接关联，但在根本上受到肾中精气的调控。肾“先天之气”与脾“后天之气”互为关联作用。肾阳不足累及脾阳亏虚，后天之精生成匮乏，进而损及肾精，形成恶性循环。本研究结果表明：补肾健脾方并不能有效回升地塞米松注射导致的体重下降，但能有效保护骨骼肌功能，并增大骨骼肌肌纤维横截面积，抑制骨骼肌萎缩，提示补肾健脾方能有效对抗地塞米松对骨骼肌蛋白的降解作用。服用补肾健脾方能拮抗地塞米松诱导的MuRF-1过度表达，进而阻断UPS信号通路，是其抑制骨骼肌蛋白降解、缓解骨骼肌萎缩、改善骨骼肌质量的机制之一。

综上所述，骨骼肌萎缩受到复杂的信号网络控制，其机制除了MuRF通路等〔11〕介导的肌蛋白降解之外，也可能由于肌蛋白合成下降。以往的研究发现，补肾方药具有双向、多靶点调节的特点〔12〕，值得进一步研究。

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〔2016-04-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金(81001565，81473583，81403279)；上海市自然科学基金(No.16ZR1437400)；上海市博士学位点建设科研重点项目(No.B201506)；上海中医药大学预算内项目(No.2014YSN04)

龚张斌(1977-)，男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中医药延缓衰老与防治老年病的机制研究。

金晔华(1991-)，女，硕士，主要从事中医药延缓衰老与防治老年病的机制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0013-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.005

1 上海中医药大学教学实验中心