高尔基体磷蛋白3在肝细胞癌中的表达特点及其临床病理学意义

（中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科，沈阳 110001）

高尔基体磷蛋白3在肝细胞癌中的表达特点及其临床病理学意义

张城硕，陈保民，焦奥，孙宁，张佳林

（中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科，沈阳 110001）

目的 探讨高尔基体磷蛋白3（GOLPH3）在肝细胞癌中的表达特点及其临床病理学意义。方法 采用免疫组织化学方法检测132例肝细胞癌与配对的癌旁组织中GOLPH3蛋白的表达情况，分析肝细胞癌组织中GOLPH3表达水平与患者组织病理学特征的关系。利用激光共聚焦显微镜检测GOLPH3蛋白在肝细胞癌细胞的亚细胞定位。结果 GOLPH3在肝细胞癌组织中的阳性表达率为70.0%（92/132），在癌旁组织中为42.4%（56/132），GOLPH3在肝细胞癌组织中的表达水平明显高于其癌旁组织（P＜0.001）。肝细胞癌组织中，GOLPH3高表达组门静脉癌栓的发生率为21.2%（14/66），而GOLPH3低表达组为6.1%（4/ 66），GOLPH3高表达组门静脉癌栓的发生率明显高于GOLPH3低表达组（P＜0.05）。激光共聚焦免疫荧光结果显示GOLPH3主要存在于肝细胞癌细胞的细胞质中，且在细胞核内存在散在性分布。结论 GOLPH3可作为一种癌基因在肝细胞癌的发生发展中发挥重要作用。

肝细胞癌；高尔基体鳞蛋白3；免疫组化；免疫荧光

原发性肝癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一，2015年我国肝癌新发病例估计为46.6万人，发病例数位居全部恶性肿瘤第4位；全年死亡病例估计为42.2万人，死亡例数位居全部恶性肿瘤第3位［1］。在原发性肝癌中，超过90%为肝细胞癌，手术切除和肝脏移植是早期肝细胞癌的主要治疗手段，然而进展期患者却常常失去手术机会［2］。因此，不断深入研究并发现肝细胞癌重要的分子标志物及关键生物治疗靶点，对于提高肝细胞癌的疗效具有重要临床意义。高尔基体磷蛋白3（Golgi phos⁃phoprotein 3，GOLPH3）是近年新发现的肿瘤相关蛋白，其定位于人染色体5p13。研究［3⁃4］表明，GOLPH3通过参与细胞内囊泡转运、受体再循环以及糖基化等多种功能影响肿瘤的发生与演进，其被陆续证实在肾癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、胶质瘤、舌癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌及横纹肌肉瘤等多种实体肿瘤中高表达［5］，但是GOLPH3在肝细胞癌中的表达及分布情况尚不十分清楚。因此，本研究拟探讨GOLPH3在肝细胞癌中的表达特点及其临床病理学意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2008年6月至2013年9月在我院接受手术并经病理证实的132例肝细胞癌及其癌旁组织石蜡标本。所有患者均有完整临床资料，且术前均未接受过放化疗或消融治疗，其中男性96例，女性36例；年龄32～79岁，平均（45.04±6.52）岁；患者随访时间3～77个月，平均33个月。肝细胞癌细胞系Huh⁃7、Bel⁃7402及MHCC⁃97H购自中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化：组织标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，制作3 μm连续切片。采用免疫组化SP法检测组织中GOLPH3的表达，SP与DAB试剂盒购自福州迈新生物科技开发有限公司，兔抗人GOLPH3多克隆抗体购自美国ABGEN公司。具体操作按试剂盒说明书进行。阴性对照以PBS代替一抗，用已知阳性标本作为阳性对照。每份标本常规HE染色，进行组织形态学观察和细胞分化程度判断。

1.2.2 染色结果判定标准：GOLPH3蛋白主要定位于细胞质中，400倍显微镜下随机选取5个视野，根据5个视野的阳性细胞的平均百分数计分。0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞＜10%；2分，阳性细胞10%～＜50%；3分，阳性细胞≥50%；染色强度：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕色3分。染色指数为上述两项相乘，所有样本的中位染色指数为GOLPH3表达高低的分级标准。

1.2.3 免疫荧光法检测：3株肝细胞癌细胞接种至载有盖玻片的12孔板内，待细胞贴壁展开，4%多聚甲醛室温下固定15 min，0.2%Triton X⁃100室温下孵育25 min，随后5%BSA室温封闭1 h，GOLPH3一抗（1∶100）4℃孵育过夜后，荧光二抗室温避光孵育2 h，DAPI染核（1∶1 000）室温避光孵育10 min后，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照，荧光二抗购自艾美捷科技有限公司，DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司，激光共聚焦显微镜购自德国徕卡公司。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，采用χ2检验对数据进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GOLPH3在肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况

免疫组化结果显示，GOLPH3主要表达于组织细胞质中，呈棕色至深棕色表达。见图1。GOLPH3在肝细胞癌组织中阳性表达率为70.0%（92/132），而在其对应癌旁组织中阳性表达率为42.4%（56/132），差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 GOLPH3在肝细胞癌组织中的表达与组织病理学特征的关系

图1 免疫组化法检测GOLPH3在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达情况 ×400Fig.1 GOLPH3 immunostaining in HCC and pericarcinoma tissues×400

在肝细胞癌组织中，GOLPH3表达水平与门静脉癌栓发生率呈正相关（χ2=6.433，P=0.020），见表1。

2.3 肝细胞癌细胞中GOLPH3的亚细胞定位

免疫荧光结果显示，在3株肝细胞癌细胞中，GOLPH3均主要表达于细胞质中，且在细胞核中存在散在性分布（图2）。

3 讨论

GOLPH3也被称为GMx33、GPP34、MIDAS或酵母Vps74p，是通过蛋白质组学分析发现的位于反面高尔基网状结构中的蛋白。GOLPH3的核苷酸序列从酵母到人类均高度保守，编码大小为34 000的蛋白质。虽然其主要位于反面高尔基网状结构（胞质面），但其在胞质、胞核及质膜也均存在表达。有研究［6］报道GOLPH3通过与磷脂酰肌醇4磷酸、MYO18A和纤维型肌动蛋白结合，在蛋白质分选等高尔基体功能中发挥作用。本研究通过免疫组化和免疫荧光等技术发现GOLPH3主要表达于肝细胞癌细胞的细胞质中，且在细胞核中存在散在性分布，说明GOLPH3可能发挥类似于转录因子的功能，进而参与某些基因的转录调控。

表1 GOLPH3表达水平与肝细胞癌组织病理学特征的关系Tab.1 Correlation between GOLPH3 expression and clinicopathological characteristics of hepatocellular carcinoma

近年来，研究［3］发现GOLPH3所在染色体5p13在肿瘤组织中频繁扩增，因此被确定为第一类高尔基体肿瘤蛋白。本研究发现GOLPH3在肝细胞癌组织中的表达明显高于其配对癌旁组织，且肝细胞癌组织中GOLPH3的表达水平与门静脉癌栓的发生率呈正相关，说明GOLPH3可能作为一个癌基因在肝细胞癌的发生发展中发挥重要作用。有关GOLPH3的调控机制涉及较广，有研究［7］报道GOLPH3通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa⁃ mycin，mTOR）信号通路调节肿瘤的发生与发展，mTOR是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其通过整合通路上游多种信号来调节细胞的增殖与存活。ZHANG等［8］报道下调GOLPH3可以抑制mTOR活性及YB1的表达，也有研究［9］发现GOLPH3可通过抑制FOXO1转录并激活AKT信号通路来促进乳腺癌细胞的增殖与肿瘤发生。GOLPH3在胶质瘤细胞中可影响RhoA表达及细胞迁移［10］。此外，ISAJI等［11］也发现GOLPH3可通过唾液酸化过程进而促进细胞的转移。鉴于GOLPH3可通过多种分子机制影响肿瘤细胞的生物学行为，其在肝细胞癌发生发展中的作用有待进一步深入研究。

图2 共聚焦显微镜检测GOLPH3在肝细胞癌细胞中的亚细胞定位 ×400Fig.2 Subcellular localization of GOLPH3 in HCC cells by laser confocal microscope×400

有研究［12］发现肿瘤组织中GOLPH3高表达可以提高以5⁃氟尿嘧啶为基础辅助化疗的结直肠癌患者的预后效果，增加结直肠癌细胞中GOLPH3的表达也可以提高肿瘤细胞对5⁃氟尿嘧啶化疗药物的敏感性。但值得注意的是，很多研究发现沉默GOLPH3可以提高细胞对化疗药物的敏感性：沉默口腔鳞状细胞癌细胞GOLPH3表达，可通过调节caspase⁃3、Bcl⁃2和细胞色素C的表达来提高化疗效果［13］。在肝细胞癌细胞中沉默GOLPH3表达，也可以增加顺铂诱导的肝细胞癌细胞的凋亡。有研究发现致DNA损伤因素可引起高尔基体重组，使高尔基体在胞质中弥散分布，而GOLPH3/MYO18A/纤维型肌动蛋白参与这种高尔基体核周弥散，抑制DNA损伤等化疗药物对细胞的损伤，但GOLPH3调控肿瘤细胞对化疗药物敏感性的具体机制尚不清楚。

mTOR复合物包括2个不同的组成部分：mTOR受体复合物（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）1和mTORC2。雷帕霉素敏感型mTORC1可激活下游核糖体蛋白S6激酶和真核生物翻译启动因子4E结合蛋白1，从而促进帽样结构依赖的蛋白质翻译过程［14］。但雷帕霉素不敏感型mTORC2可促进AKT在Thr308位点的磷酸化，从而使AKT的活力最大化［15］。AKT的高度活化会促进细胞生长、增殖及存活，同时抑制细胞的凋亡［16］。需要注意的是，mTORCl抑制后会通过核糖体蛋白S6激酶和胰岛素受体底物1负反馈调节，激活mTORC2信号通路，进而弱化了mTORCl的抗肿瘤效应［17］。由此可见，mTORC1与mTORC2在机体内发挥截然相反的生物学效应。因此，GOLPH3可能在不同的细胞中与mTORC1/mTORC2结合的比例不同，进而对化疗药物敏感性产生上述不同的影响。但该假设尚需进行进一步相关研究予以证实。

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（编辑 陈 姜）

Expression of Golgi Phosphoprotein 3 in Human Hepatocellular Carcinoma and Its Clinicopathological Significance

ZHANG Chengshuo，CHEN Baomin，JIAO Ao，SUN Ning，ZHANG Jialin
（Department of Hepatobiliary Surgery and Unit of Organ Transplantation，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the expression characteristics of Golgi phosphoprotein 3（GOLPH3）in human hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its clinicopathological significance.Methods The expressions of GOLPH3 protein was detected in 132 cases of paired paraf⁃fin embedded HCC specimens and pericarcinoma tissues using immunohistochemical staining，and the relation of the expression of GOLPH3 to clinicopathologic features was analyzed.Meanwhile，the expression and distribution of GOLPH3 in HCC cells was observed by laser confocal mi⁃croscopy.Results The positive expression rates of GOLPH3 in HCC and pericarcinoma tissues were 70.0%（92/132）and 42.4%（56/132）（P＜0.001），respectively.The incidence of portal vein tumor thrombus in high and low GOLPH3 expression groups of HCC were 21.2%（14/66）and 6.1%（4/66）（P＜0.05），respectively.The expression rate of GOLPH3 in HCC was significantly higher than that in pericarcinoma tissues，and the expression of GOLPH3 in HCC was positively related to portal vein tumor thrombus.In addition，GOLPH3 was mainly expressed in cyto⁃plasm of HCC cells，and there was also scattered distribution in the nucleus.Conclusion GOLPH3acts as an oncogene and may play vital roles in the carcinogenesis and development of HCC.

hepatocellular carcinoma；Golgi phosphoprotein 3；immunohistochemistry；immunofluorescence

R735.7

A

0258-4646（2017）03-0214-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.006

辽宁省自然科学基金（201602874）

张城硕（1987-），男，讲师，博士.

张佳林，E-mail：jlzhang@cmu.edu.cn

2016-09-26

网络出版时间：