红景天苷对高糖诱导的血管平滑肌细胞中线粒体过度分裂的作用及机制※

庄心宇，高秀芳，施海明



·基础医学论著/研究·

红景天苷对高糖诱导的血管平滑肌细胞中线粒体过度分裂的作用及机制※

庄心宇，高秀芳，施海明

目的 探讨中药红景天苷对高糖培养的血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖和线粒体动力学的调控作用及机制。方法 将对数增殖期的VSMCs随机分为低糖(5 mmol/L)培养和高糖(25 mmol/L)培养两组，每组再分为5个亚组，分别在普通培养基(对照组)、低浓度红景天苷(0.3 mmol/L)、高浓度红景天苷(0.5 mmol/L)、低浓度Mdivi-1(10 μmol/L)、高浓度Mdivi-1(25 μmol/L)5种干预条件下培养24 h，采用Western Blot和real time PCR检测线粒体动力学相关蛋白Drp1和Mfn2的表达水平，采用激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体内膜情况，Image J软件分析线粒体碎片计数(MFC)。后用siRNA抑制Mfn2，观察VSMCs增值情况。结果 在高糖培养条件下，VSMCs过度增殖，同时线粒体分裂增多，Drp1表达增加，Mfn2表达减少。红景天苷和Mdivi-1干预条件下，VSMCs，线粒体分裂，Drp1表达均明显受抑制，而Mfn2表达增加。抑制Mfn2表达，VSMCs增殖部分恢复高糖水平。结论 红景天苷可以部分通过抑制线粒体分裂(下调Drp1和上调Mfn2)抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞过度增殖。

红景天苷；血管平滑肌细胞；细胞增殖；线粒体动力学

尽管有大量相关的基础和临床研究，心血管疾病仍然是全球患病率和死亡率最高的疾病之一[1]。糖尿病作为心血管疾病的等危症，能够显著增加冠心病的风险，并且在糖尿病相关死亡中由缺血性心血管并发症导致的高达75%[2]。糖尿病动物模型和糖尿病病人的动脉组织病理检查均显示原本处于动脉中膜的血管平滑肌细胞(VSMCs)过度增殖，并迁移至动脉内膜，伴随细胞外基质合成增多，最终导致动脉壁增厚和血管狭窄。因此，糖尿病病人冠心病死亡率和冠状动脉支架后再狭窄率增加[3]。线粒体产能是哺乳动物主要的能量来源。线粒体动力学是通过调节线粒体融合和分裂过程来维持网络稳态的过程。线粒体融合-分裂的相对速率影响线粒体形态、数量和分布特征，这一过程被与动力蛋白相关的GTP蛋白酶精细调控，包括线粒体融合相关蛋白-1(Mfn1)、线粒体融合相关蛋白-2(Mfn2)、线粒体分裂相关蛋白，如线粒体分裂蛋白1(Drp1)和分裂蛋白1(Fis1)[4]。其中，Drp1已被证实在细胞存活、凋亡和线粒体自噬中均发挥重要作用[5-7]。

线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)是一种高效的小分子物质，通过阻断Drp1自我组装，选择性地抑制其GTP蛋白酶活性，快速可逆性且剂量依赖性地抑制网络状线粒体形成[8-9]。已有研究提示Mdivi-1的半抑制浓度(IC50)为10 μmol/L并且最高作用剂量可达100 μmol/L[10]。近几年来，越来越多的研究发现线粒体动力学相关蛋白和血管平滑肌细胞增殖有关，并可能成为一个新的干预靶点。但是糖尿病情况下，通过影响线粒体动力学而影响VSMCs增殖的作用，还未有相关研究证实。

红景天苷(p-对羟基苯-bD-葡萄糖苷)是传统中药红景天中的主要活性成分[11]。先前研究发现红景天苷对神经、心脏、肝脏和血管均可发挥一定的保护作用并且参与调节血糖代谢[12-16]。同时，在体外试验中，利用次氯酸诱导的红细胞内发生氧化应激，证实红景天苷能够对抗氧化应激效应[17-18]。上述结果提示红景天苷可以成为抑制高糖情况下VSMCs增殖，调控线粒体动力学的有效药物治疗。

本实验旨在研究红景天苷是否能通过调节线粒体动力学从而抑制高糖诱导的VSMCs过度增殖，同时比较红景天苷和Mdivi-1对线粒体动力学的调节作用差异，初步探讨红景天苷发挥保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠VSMCs购自上海然泰生物制品公司，低糖DMEM和高糖DMEM培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自Sigma公司，红景天苷购自雷允上药业，BrdU试剂盒、鼠抗Drp 1、抗Mfn2抗体购自Abcam公司，Mito-Tracker红购自Beyotime生物科技，ECL化学发光试剂盒购自Millipore公司，兔抗GAPDH抗体购自Santa Cruz生物科技，总RNA提取试剂盒、cDNA合成逆转录酶试剂盒购自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs培养 用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的恒温箱中培养，每2 d～3 d换液1次。

1.2.2 实验分组 将对数增殖期的VSMCs随机分为低糖(5 mmol/L)和高糖(25 mmol/L)培养组，每一组又分为5个亚组，分别在普通培养基(对照组)、低浓度红景天苷(0.3 mmol/L)、高浓度红景天苷(0.5 mmol/L)、低浓度Mdivi-1(10 μmol/L)、高浓度Mdivi-1(25 μmol/L)5种干预条件下培养24 h后，进行下游实验。

1.2.3 BrdU法检测VSMCs增殖情况 各组细胞培养24 h后根据BrdU试剂盒说明书操作，测定各组细胞增殖情况，实验独立重复3次，每次每组设3个复孔。

1.2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察 观察各组细胞Mito-Tracker红染色30 min后线粒体内膜情况。放大倍数为400×和3 000×。Image J软件分析线粒体碎片计数(MFC)。

1.2.5 Western blot检测VSMCs中Drp-1和Mfn2蛋白表达水平 红景天苷和Mdivi-1干预各组细胞24 h后，根据Western blot常规操作流程，一抗4 ℃过夜，各亚组分别用鼠抗Drp1(1∶500)和鼠抗Mfn2(1∶500)和兔抗GAPDH (1∶1 000)。洗涤后加入二抗(1∶5 000)作用1 h。利用ECL 化学发光试剂盒进行信号检测。

1.2.6 实时定量PCR分析 提取VSMCs中的总RNA，根据cDNA合成逆转录酶试剂盒说明进行，引物序列设计如表1。利用SYBR®3Premix Ex TaqTMII定量实时PCR，根据相对mRNA 表达比例计算公式[19]计算。

表1 实时RT-PCR分析引物序列

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件进行分

用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(组间两两比较用SNK法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 红景天苷抑制高糖条件下VSMCs的增殖 与低糖条件相比，高糖可明显诱导VSMCs增殖。低糖条件下，各亚组间VSMCs的增殖差异无统计学意义；高糖条件下，与对照组比较，0.5 mmol/L红景天苷对VSMCs增殖有明显抑制作用；与0.3 mmol/L红景天苷相比，0.5 mmol/L红景天苷对VSMCs增殖的抑制作用更明显。详见图1。

注：与低糖对照组比较，*P<0.01；与高糖对照组比较，**P<0.01。

图1 红景天苷对低糖和高糖条件下VSMCs增殖的作用

2.2 红景天苷抑制高糖条件下线粒体过度分裂(见图2～图4) 高糖能够诱导球状线粒体增加并导致线粒体聚集。从线状线粒体显著增加的比例和线粒体密度减低可以看出红景天苷和Mdivi-1可以抑制线粒体分裂，促进线粒体融合，且作用均显示出浓度依赖性(线粒体融合定义为：球状线粒体占据总线粒体<35%；线粒体分裂定义为：球状线粒体占据总线粒体>65%)。考虑到红景天苷可以抑制血管平滑肌细胞增殖，同时也可以抑制线粒体分裂，因此认为其对于血管平滑肌细胞增殖的抑制作用可能是通过抑制线粒体分裂实现的。

注：与高糖对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图2 免疫荧光显微镜观察线粒体密度和形态

图4 红景天苷对高糖条件下球状线粒体/总线粒体比例的影响

2.3 红景天苷对VSMCs中线粒体动力学相关蛋白的作用(见图5) 在高糖条件下，Drp1水平上调，伴随线粒体分裂增加。Mdivi-1可以有效地抑制该现象并且剂量依赖性的上调Mfn2。红景天苷对Drp1和Mfn2有相似的调节作用。尽管0.3 mmol/L红景天苷亚组和高糖对照组比较差异无统计学意义，抑制趋势已经明显存在。而0.5 mmol/L红景天苷和10 μmol/L Mdivi-1在下调Drp1和上调Mfn2水平上作用差异无统计学意义。提示红景天苷可能对线粒体动力学失衡发挥治疗作用。

注：A、B、C为Drp1和Mfn2的相对蛋白表达水平；D、E为Drp1和Mfn2的相对mRNA表达水平，每组实验重复3次。

图5 红景天苷对高糖条件下VSMCs中Drp1和Mfn2的作用

2.4 红景天苷通过上调Mfn2表达抑制血管平滑肌细胞增殖 与单用红景天苷干预的亚组相比，Mfn2-siRNA亚组VSMCs增殖明显增加，尽管其增殖水平仍然和高糖对照组比较差异有统计学意义。这一结果提示Mfn2是红景天苷抑制高糖诱导的VSMCs增殖作用过程中的调节靶点，但不是唯一的作用靶点。详见图6。

图6 红景天苷通过上调Mfn2表达抑制血管平滑肌细胞增殖

3 讨 论

线粒体动力学受到一组相关蛋白(例如Drp1和Mfn2)的调控[20]，这一过程对于维持线粒体稳态十分重要。而线粒体功能失调可能导致一系列疾病的发生和进展[21]。Mashboom等研究报道Mdivi-1能够对于肺动脉高压有治疗作用，通过有效地抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，下调Drp1表达，同时，在过负荷心衰小鼠[22]颈动脉放置支架模型中，证实Mdivi-1可逆转上调的Drp1和下调的Mfn2水平，抑制动脉管壁增厚和血管平滑肌细胞过度增殖。重要的是，病毒转录诱导Mfn2过表达[23]可能防治支架放置后狭窄。这些研究反映出线粒体动力学相关蛋白和血管平滑肌细胞增殖的紧密联系。但是目前仍然没有关于高糖情况下抑制线粒体分裂对于血管平滑肌细胞增殖的治疗作用的研究。本实验发现：Mdivi-1作为Drp1特异性抑制剂，可以通过下调Drp1和上调Mfn2在基因和蛋白水平的表达情况而抑制线粒体分裂和重新构建线粒体网络稳态，并且抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞过度增殖。

红景天苷是一种从原生植物红景天中提取的苯丙素苷，已有研究证明其改善内皮功能和延缓动脉粥样硬化的作用[14]。在自发性糖尿病(Goto-Kakizaki)大鼠动物模型中，红景天苷显示出对扩张血管的保护性作用[15]。本研究证实红景天苷能够抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞过度增殖和线粒体过度分裂。鉴于没有关于高糖情况下线粒体动力学对于血管平滑肌细胞增殖作用的研究，我们首次证明红景天苷可以部分的通过抑制线粒体分裂(下调Drp1和上调Mfn2)来抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞过度增殖。尽管确切的抑制还需要进一步研究，但红景天苷可以通过维持线粒体动力学稳态治疗心血管疾病。

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(本文编辑郭怀印)

Impact of Salidroside on Mitochondrial Fission in Vascular Smooth Muscle Cells under High Glucose Conditions and Its Possible Mechanism

Zhuang Xinyu，Gao Xiufang，Shi Haiming

Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200036，China

Gao Xiufang

Objective To investigate the impact of salidroside on vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and mitochondrial dynamics under high glucose conditions，and its possible mechanism.Methods The VSMCs in proliferative phase were randomly divided into two groups：low glucose group cultured low glucose (5 mmol/L)，and high glucose group cultured high glucose (25 mmol/L).Then VSMCs in each group were divided into five subgroups：control group，low concentration salidroside group (0.3 mmol/L)，high concentration salidroside group (0.5 mmol/L)，low concentration Mdivi-1 group (10 μmol/L)，high concentration Mdivi-1 group (25 μmol/L).VSMCs were cultured by low or high concentration of salidroside or Mdivi-1 under high glucose or low glucose condition for 24 hours.The expressions of proteins related to mitochondrial dynamics including dynamin-related protein (Drp1) and mitofusin 2(Mfn2) were tested by western blot and real-time polymerase chain reaction (PCR).The mitochondria inner membrane was observed under laser scanning confocal microscope (LSCM).The mitochondrial fission count (MFC) was analyzed by Image J software.Then Mfn2 was inhibited by small interfering RNA (siRNA).VSMCs proliferation was observed.Results VSMCs was abnormally proliferated，mitochondrial fission increased，Drp1 expression increased，and Mfn2 expression reduced under high glucose condition.Salidroside and an inhibitor of Drp1 (Mdivi-1) can inhibit VSMCs proliferation，Drp1 expression and mitochondrial fission and up-regulate Mfn2 expression (all P<0.05).After using siRNA to silence Mfn2 expression，the inhibitive effect on VSMCs proliferation can be partly reversed.Conclusion Salidroside can inhibit VSMCs proliferation induced by high-glucose and may act its therapeutic effect via inhibiting mitochondrial fission by down-regulation of Drp1 expression and up-regulation of Mfn2 expression.

salidroside；vascular smooth muscle cells；proliferation；mitochondrial dynamics

复旦大学附属华山医院(上海 200036)

高秀芳，E-mail：sophiakao@126.com

R329.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.008

1672-1349(2017)01-0029-05

2016-10-08)

※第十四次全国中西医结合心血管病学术会议获奖论文

引用信息：庄心宇，高秀芳，施海明.红景天苷对高糖诱导的血管平滑肌细胞中线粒体过度分裂的作用及机制[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(1)：29-33.